農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花椰菜遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建與應(yīng)用研究.pdf

1、本研究在優(yōu)化花椰菜再生體系的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系。應(yīng)用該遺傳轉(zhuǎn)化體系，將白菜的 BpERF1(ethylene responsive factor)基因和辣椒的CaNAC1(NAM，ATAF and CUC2)基因進(jìn)行了花椰菜雪白、松花的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因植株，并研究了外源基因表達(dá)對轉(zhuǎn)基因植株抗病性的影響，試驗(yàn)的主要研究結(jié)果如下： 1、建立了花椰菜離體再生體系 試驗(yàn)對影響花椰菜再生的基因型、苗齡、激素

2、、AgNO3等因素進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：不同基因型的離體再生差異顯著，雪白、松花在最適培養(yǎng)條件下再生率為95％左右，而臺(tái)寶僅為65％左右；培養(yǎng)6d的無菌苗下胚軸分化能力最佳；細(xì)胞分裂素類與生長素類植物生長調(diào)節(jié)劑不同濃度配合使用對外植體再生頻率影響顯著，其中在MS中添加3.0mg/L6-BA和0.2mg/LIAA時(shí)，雪白下胚軸的分化率達(dá)到95.7％，平均出芽數(shù)為3.9個(gè)，并且能很好地減小玻璃化程度；AgNO3對再生有很好的促進(jìn)作用，隨著濃

3、度的增加效果更明顯，當(dāng)達(dá)到4.0mg/L時(shí)雪白的轉(zhuǎn)化率達(dá)97％，但當(dāng)達(dá)到6mg/L時(shí)分化率有所下降。 2、建立了花椰菜遺傳轉(zhuǎn)化體系 選擇潮霉素濃度5mg/L為臨界篩選濃度；羧芐青霉素初始抑菌濃度為500mg/L，并在繼代培養(yǎng)時(shí)逐漸降低至200mg/L，并且再生頻率和抑菌效果非常理想；此外，還研究了卡那霉素篩選體系，確定最適宜的卡那霉素濃度為10mg/L。最終確定了最優(yōu)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花椰菜轉(zhuǎn)化體系為：預(yù)培養(yǎng)2d、菌液濃度O

4、D600為0.4-0.6，3-5min侵染，3d共培養(yǎng)，延遲14d的篩選培養(yǎng)方式。 3、花椰菜轉(zhuǎn)化大白菜BpERF1基因的抗性再生植株的獲得及其分子檢測和抗病性鑒定 利用本研究所構(gòu)建的花椰菜農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因體系，對克隆在pMDC32載體上的外源大白菜BpERF1基因進(jìn)行了花椰菜遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了10株潮霉素抗性再生植株。PCR檢測6株呈陽性，表明大白菜BpERF1基因已整合進(jìn)這些植株的因組DNA中。初步的草酸侵染離體葉片