小麥抗白粉病相關(guān)基因的克隆與分析.pdf

1、小麥白粉病是由專性寄生菌禾布氏白粉菌[Blumeria graminis(DC.) Speer f. sp. tritici Em. Marchal(Bgt)]引起的真菌性病害，在全世界范圍均有發(fā)生。隨著施肥、灌溉等條件的改善，小麥白粉病的發(fā)病范圍有蔓延的趨勢，特別是在濕度大的地區(qū)發(fā)病尤為嚴(yán)重。小麥從一葉期到衰老都會受到白粉菌的威脅，在生長早期被侵染可以使小麥的分蘗大為減少，生長后期葉部或穗部被侵染會直接影響籽粒數(shù)。改變耕作方式在一定程

2、度上可以降低白粉病的發(fā)生，但易受到氣候等條件的影響。使用農(nóng)藥等化學(xué)手段雖有成效，但大面積的使用不但會增加入力、財力和物力，更重要的是會給環(huán)境造成嚴(yán)重的污染，最終影響人類的健康，所以推廣抗性品種成為目前最為經(jīng)濟和有效的措施，但由于白粉菌生理小種的變異速度快，單一抗性品種的抗病性很容易喪失，因此通過傳統(tǒng)或基因工程育種等方法培育具有多個抗病基因聚合的持久抗病品種成為抗病育種的主要方向，而加強抗病機制的研究成為實現(xiàn)這一目標(biāo)的工作重點。
　

3、　 小麥農(nóng)家品種紅蚰麥(HYM)對本實驗室所保存的白粉菌具有良好的抗病性，表現(xiàn)為免疫。在前期工作中，利用紅蚰麥和感病品種豫麥13(YU13)雜交后的F3代純合抗病、感病單株分別構(gòu)建抗、感池，同時設(shè)置了經(jīng)白粉菌誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)兩種處理，通過與Affymetrix基因芯片雜交，經(jīng)數(shù)據(jù)處理獲得大量與抗病反應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本。本研究以基因芯片提供的探針序列為基礎(chǔ)，利用電子克隆和定量PCR等技術(shù)對其進(jìn)行初步分析，得出以下結(jié)果：
　　 1.小麥抗

4、白粉病相關(guān)基因的克隆
　　 選擇與植物抗病反應(yīng)緊密相關(guān)基因的探針序列，通過電子克隆獲得目標(biāo)基因的全長DNA序列，并根據(jù)此序列設(shè)計引物，分別在小麥感病品種豫麥13和抗病品種紅蚰麥中同時成功的克隆了富含亮氨酸結(jié)構(gòu)域、類受體激酶、絲氨酸蘇氨酸激酶、病程相關(guān)蛋白1、病程相關(guān)蛋白2和三種草酸氧化酶基因。白粉病抗病同源基因Mlo在HYM和YU13中均被成功克隆，序列分析表明，這西條DNA序列只有一個核苷酸的差異，與大麥Mlo的DNA序列相似

5、性均高達(dá)90％。氨基酸序列分析顯示，二者的前18個氨基酸是信號肽序列，是具有7次跨膜結(jié)構(gòu)域的膜蛋白，451、459、462、475、483位點為糖基化位點，在414～435位置上的氨基酸是整個蛋白的活性中心.蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測進(jìn)一步表明，由于二者具有一個核苷酸差異導(dǎo)致在YU13中446位上的Gly而在HYM中變?yōu)镾er,這一微小變化導(dǎo)致三級結(jié)構(gòu)的顯著差異。同時在紅蚰麥中成功克隆了小麥白粉病Pm3b抗病同源基因(Pm3HYM)，擴增長度為

6、4208bp，具有長度為3777bp的完整ORF，編碼1258個氨基酸，蛋白結(jié)構(gòu)分析表明它具有抗病蛋白必須的P-loop NTPase和LRR結(jié)構(gòu)域，聚類分析揭示其在所有小麥同源序列中的獨特位置，可能預(yù)示著其具有特殊的功能。以上克隆的這些基因都是與植物抗病反應(yīng)密切相關(guān)的基因，這些結(jié)果為下一步的分析奠定基礎(chǔ)。
　　 2.小麥抗白粉病相關(guān)基因的表達(dá)模式分析
　　 選擇Pathogenesis-related protein1

7、.2(PR1.2)、Receptor-like kinase protein(RLK)、Serine/threonine kinase(S7K)、與大麥同源的Mlo、與Pm3b同源的Pm3HYM等五個基因作為研究對象，根據(jù)克隆的基因的DNA序列設(shè)計引物，應(yīng)用定量PCR技術(shù)分析它們在白粉菌誘導(dǎo)的72h或96h的表達(dá)趨勢。結(jié)果顯示PR1.2在HYM中表達(dá)高峰出現(xiàn)在12h，而在YU13中的表達(dá)高峰出現(xiàn)在18h；RLK在HYM中沒有明顯的表達(dá)高

8、峰，在YU13中表達(dá)高峰出現(xiàn)在24h;HYM中的STK在24h時就出現(xiàn)表達(dá)高峰，而在YU13中沒有明顯的上調(diào)表達(dá)；Mlo在YU13中72h時有較強的上調(diào)表達(dá)，而HYM在12h時即有上調(diào)表達(dá)；Pm3HYM受到白粉菌誘導(dǎo)后立即出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，并在12h時達(dá)到表達(dá)高峰。除了PR1.2、RLK的表達(dá)模式與芯片結(jié)果不一致外，其它的均與芯片一致。從以上結(jié)果可以看出，這些基因是否被誘導(dǎo)表達(dá)以及表達(dá)高峰出現(xiàn)的早晚與抗病反應(yīng)有著密切關(guān)系。
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9、.小麥Pm3b同源基因(Pm3HYM)VIGS載體的構(gòu)建
　　 為了進(jìn)一步確定克隆的抗病相關(guān)基因在抗病反應(yīng)中的作用，本研究擬利用大麥條斑病毒介導(dǎo)的單子葉植物高效基因沉默系統(tǒng)對目標(biāo)基因進(jìn)行沉默，從而達(dá)到驗證基因功能的目的。以Pm3HYM作為功能驗證的目標(biāo)，將連接有Pm3HYM基因的pMD19-T載體為PCR擴增的模板，并分別擴增兩個不同的DNA區(qū)段作為兩個沉默目標(biāo)，一個在編碼區(qū)中間位置，另一個在mRNA的3’端非翻譯區(qū)。隨后通過酶