月季抗白粉病基因Mlo的克隆和功能分析.pdf

1、由白粉病菌（Podosphera pannosa）引起的白粉病害(Powdery mildew)是全球切花月季(Rosa hybrida)生產(chǎn)的第一大病害，也是庭院月季和盆花月季的主要病害之一。中國(guó)是全球薔薇野生資源的分布中心之一，也是全球切花月季的主產(chǎn)區(qū)之一，但是對(duì)薔薇野生資源的優(yōu)異性狀或基因缺乏研究，從而制約了該類資源在現(xiàn)代月季遺傳改良中的應(yīng)用。Mlo基因是一類新發(fā)現(xiàn)的抗病基因，一些雙子葉植物（如擬南芥、豌豆、番茄）隱形突變的Mlo

2、基因讓其獲得了廣譜高抗的抗病性。
　　本研究以野薔薇（又稱多花薔薇）(R.multiflora)及其雜交后代為研究材料，通過(guò)同源克隆法從中獲得4個(gè)Mlo的全長(zhǎng)cDNA和genomic DNA序列，再采用相關(guān)分析軟件對(duì)這4個(gè)目的基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析;然后以BC1(2n=2x)分離群體為材料，采用遺傳連鎖圖譜技術(shù)對(duì)4個(gè)候選基因進(jìn)行定位分析;而后利用實(shí)時(shí)熒光定量qPCR技術(shù)分析4個(gè)目的基因的時(shí)空表達(dá)規(guī)律;最后構(gòu)建候選基因RhMLO1的正義表

3、達(dá)載體和反義抑制載體，分別轉(zhuǎn)化‘白玉'材料并獲得轉(zhuǎn)基因植株，比較轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照植株白粉病抗性上的差異，從“得”和“失”兩個(gè)角度以及正反兩面去驗(yàn)證該基因在月季中的功能。本研究獲得的結(jié)果和主要結(jié)論如下:
　　1、四個(gè)月季Mlo基因的克隆與序列分析
　　以野薔薇及其雜交后代為材料，采用RT-PCR和RACE等技術(shù)克隆得到四個(gè)月季白粉病抗病候選基因的cDNA和gDNA全長(zhǎng)序列，分別命名為RhMLO1-RhMLO4。RhMLO1-R

4、hMLO4四個(gè)基因的cDNA全長(zhǎng)分別為1779 bp、1767bp、1692 bp和1695 bp，它們的最大開放閱讀框分別編碼592、588、563和564個(gè)氨基酸。其編碼蛋白均包含7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域及兩個(gè)典型的MLO模體結(jié)構(gòu)，即Calmodulin-binding-site(CaMBD)和C末端的D/E-F-S/T-F結(jié)構(gòu)域。RhMLO1-RhMLO4的蛋白分子量分別為67.79 kDa、67.22 kDa、64.55 kDa和64.6

5、1 kDa，理論等電點(diǎn)分別為9.53、8.96、9.00和9.26。RhMLO1-RhMLO4四個(gè)基因的基因組序列長(zhǎng)度分別為6.1 kb、3.7 kb、9.3 kb和3.5 kb，序列分析顯示這四個(gè)基因均包含15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子。上述研究結(jié)果說(shuō)明RhMLO1-RhMLO4四個(gè)基因是Mlo基因家族的新成員，同時(shí)也為進(jìn)一步研究這四個(gè)基因的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)。
　　用該四個(gè)基因所編碼的蛋白序列與其他作物MLO蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)

6、果表明:月季的MLO序列與擬南芥、番茄、豌豆等雙子葉植物的同源關(guān)系更近，與大麥、小麥、水稻和玉米等單子葉植物的親緣關(guān)系更遠(yuǎn)，這一結(jié)果與植物學(xué)傳統(tǒng)分類系統(tǒng)一致。
　　2四個(gè)月季Mlo基因的遺傳連鎖圖譜構(gòu)建
　　通過(guò)PCR-SSCP技術(shù)，利用JoinMap2.0軟件構(gòu)建了四個(gè)Mlo基因的遺傳連鎖圖譜。結(jié)果表明:RhMLO1基因定位在5號(hào)連鎖群NBS104-3_1與CAg-ATg355-3_1兩標(biāo)記之間，RhMLO2基因定位在3號(hào)

7、連鎖群上并與重瓣花相關(guān)基因Blfo的遺傳距離較近，RhMLO3和RhMLO4基因緊密連鎖并定位在1號(hào)連鎖群上，該區(qū)域附近有月季黑斑病抗性相關(guān)基因和白粉病抗性相關(guān)數(shù)量性狀基因。這四個(gè)Mlo基因的定位結(jié)果將對(duì)我們下一步利用分子標(biāo)記輔助育種的實(shí)踐工作具有重要的指導(dǎo)意義。
　　3四個(gè)月季Mlo基因的時(shí)空表達(dá)分析
　　利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)四個(gè)目的基因進(jìn)行了時(shí)空表達(dá)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:RhMLO1和RhMLO2基因在不同組織部

8、位及不同脅迫中的表達(dá)模式趨于一致，兩者在不同脅迫下均表現(xiàn)為積極響應(yīng)誘導(dǎo)上調(diào)，并且在受白粉病菌侵染的不同階段均表現(xiàn)為表達(dá)量明顯上調(diào)趨勢(shì)。因此，RhMLO1和RhMLO2基因有可能在月季與白粉病菌互作的過(guò)程中扮演著重要角色。
　　4候選基因RhMLO1的功能驗(yàn)證
　　通過(guò)酶切和連接等步驟，分別構(gòu)建了月季RhMLO1基因的正義表達(dá)載體和反義抑制表達(dá)載體，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別對(duì)‘白玉'植株材料的體細(xì)胞胚進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。利用PCR法和