簇毛麥抗白粉病基因StpK-V及其直系同源基因啟動(dòng)子的克隆和特征分析.pdf

1、由專性寄生真菌小麥白粉病菌(Blumeriagraminisf.sp.tritici)引起的小麥白粉病是世界上許多國(guó)家小麥生產(chǎn)中危害日趨嚴(yán)重的病害之一，來(lái)自于小麥近緣物種簇毛麥的抗白粉病基因Pm21對(duì)白粉病抗性強(qiáng)、抗譜廣，已經(jīng)作為我國(guó)小麥抗白粉病育種的新一代抗源被廣泛利用。本實(shí)驗(yàn)室曹愛忠等(2006)通過(guò)基因芯片雜交技術(shù)篩選到一個(gè)白粉菌誘導(dǎo)后上調(diào)表達(dá)的抗病相關(guān)基因Stpk-Ⅴ，并獲得了它的全長(zhǎng)cDNA序列。把該基因轉(zhuǎn)入感病小麥可提高其抗

2、病性，推測(cè)Stpk-Ⅴ基因可能是Pm21位點(diǎn)的重要組成部分。雖然在普通小麥揚(yáng)麥158中存在stpk-Ⅴ的直系同源基因Ta-A-Stpk，Ta-B-Stpk，Ta-D-Stpk，但該品種沒有表現(xiàn)出對(duì)白粉病抗性的原因仍然未知。為了進(jìn)一步研究基因stpk-Ⅴ和直系同源基因在抗白粉病功能上的差異，本研究開展了對(duì)基因的啟動(dòng)子扣基因功能分析兩個(gè)方面的工作:
　　1、將胡佳夢(mèng)(2010)從普通小麥cDNA中克隆得到的stpk-Ⅴ的同源基因Ta-

3、D-Stpk構(gòu)建超表達(dá)載體，利用基因槍轉(zhuǎn)化法將Ta-D-Stpk轉(zhuǎn)到感病小麥揚(yáng)麥158中，進(jìn)行功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證Ta-D-Stpk基因是否具有抗白粉病功能;
　　2、根據(jù)Stpk-Ⅴ啟動(dòng)子的序列設(shè)計(jì)引物，利用同源克隆法克隆Stpk-Ⅴ及其在普通小麥A、B、D三個(gè)基因組中直系同源基因的啟動(dòng)子，將這些啟動(dòng)子分別命名為pStpk-Ⅴ，pTa-A-Stpk，pTa-B-Stpk和pTa-D-Stpk。將這些啟動(dòng)子分別置于GFP之前，融合載

4、體分別命名為pSGFP-pStpk-Ⅴ,pSGFP-pTa-A-Stpk,pSGFP-pTa-B-Stpk,pSGFP-pTa-D-Stpk,利用瞬間表達(dá)方法檢測(cè)這些啟動(dòng)子是否具有組成型表達(dá)活性。同時(shí)，將這些啟動(dòng)子置于GUS之前，融合載體分別命名為pAHC25-pBI220-pStpk-Ⅴ，pAHC25-pBI220-pTa-A-Stpk,pAHC25-pBI220-pTa-B-Stpk,pAHC25-pBI220-pTa-D-Stpk

5、,利用瞬間表達(dá)方法檢測(cè)這些啟動(dòng)子是否具有白粉菌誘導(dǎo)表達(dá)活性，檢測(cè)是否是啟動(dòng)子的差異造成簇毛麥基因與普通小麥直系同源基因在白粉病抗性上的差異。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:
　　1、在轉(zhuǎn)化了pSGFP的陽(yáng)性對(duì)照葉片上，有大量GFP表達(dá)細(xì)胞，而轉(zhuǎn)化了pSGFP-pStpk-Ⅴ，pSGFP-pTa-A-Stpk，pSGFP-pTa-B-tpK和pSGFP-pTa-D-Stpk的葉片上，僅有個(gè)別細(xì)胞中有GFP基因表達(dá)，且信號(hào)微弱，所以pStp

6、k-Ⅴ，pTa-A-Stpk，pTa-B-Stpk和pTa-D-Stpk不具有組成型啟動(dòng)子特征，是非組成型啟動(dòng)子。
　　2、分別轉(zhuǎn)化pAHC25-pBI220-pStpk-Ⅴ，pAHC25-pBI220-pTa-A-Stpk，pAHC25-pBI220-pTa-B-Stpk和pAHC25-pBI220-pTa-D-Stpk四種表達(dá)載體的揚(yáng)麥158葉片表皮，在未接種白粉菌的葉片上觀察不到GUS基因表達(dá)的細(xì)胞，然而接種白粉菌的葉片上都

7、能夠觀察到有GUS表達(dá)的細(xì)胞，并且在轉(zhuǎn)化pAHC25-pStpk-Ⅴ表達(dá)載體的葉片中觀察到的GUS細(xì)胞數(shù)目比轉(zhuǎn)化pAHC25-pBI220-pTa-A-Stpk，pAHC25-pBI220-pTa-B-Stpk，pAHC25-pBI220-pTa-D-Stpk表達(dá)載體的葉片中觀察到的GUS細(xì)胞數(shù)目多，由此推測(cè)簇毛麥Stpk-Ⅴ基因的啟動(dòng)子pStpk-V和普通小麥揚(yáng)麥158Stpk基因的啟動(dòng)子pTa-A-Stpk，pTa-B-Stpk和p