大豆疫霉根腐病抗性相關基因PR10和PRP功能的初步研究.pdf

1、大豆疫霉根腐病是由大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）引起的土傳性的毀滅病害。在我國，黑龍江、安徽、山東、河南、江蘇、浙江、福建、新疆等地區(qū)均有Phytophthora sojae的報道。黑龍江省是我國大豆的主產區(qū)，且大豆疫霉根腐病在該省發(fā)病面積連年增加，嚴重危害我國大豆的生產。
　　 迄今為止，防治該病最為有效的手段就是選用抗病品種。大豆疫霉菌毒力結構趨于復雜化、生理小種進化速度快;而常規(guī)的育種工作周期長，工作效

2、率低，抗性資源有限，很難滿足生產的需要。因此，解析大豆抗疫霉根腐病分子機理進而利用抗病基因工程育種是解決該難題的有希望的途徑之一。
　　 植物為了抵抗病原微生物的侵害，在長期進化過程中，逐漸形成了一系列復雜而有效的保護機制和防御網(wǎng)絡。植物防衛(wèi)反應中表達的基因主要是編碼病程相關蛋白（pathogenesisrelated proteins，PR蛋白）基因和植保素合成相關酶的基因。課題組以高抗大豆品種“綏農10”為試驗材料構建的受疫

3、霉菌誘導后差異表達的cDNA消減文庫的基礎上，選取了文庫中經(jīng)本地Blast比對后發(fā)現(xiàn)與其它植物的病程相關蛋白類基因具有較高同源性的高上調表達的EST序列進行研究，并用RACE技術擴增了病程相關蛋白類基因PR10(pathogenesis-related protein10)基因和PRP(pathogenesis-related protein)基因，本研究在上述基礎上對兩個基因的功能進行了初步研究，對豐富大豆病程相關蛋白基因理論和實踐抗

4、病基因工程育種都具有十分重要的意義。
　　 具體研究結果如下:
　　 1.將PR10和PRP基因構建到pET-29b(+)原核表達載體上，在37℃，IPTG濃度0.5mM，誘導4h條件下，獲得以包涵體形式存在的融合蛋白，其大小約為17.14kDa和30kDa。將該His-PR10和His-PRP融合蛋白分離純化，成功復性后，進行體外抑制大豆疫霉根腐病1號生理小種菌絲體生長試驗，結果表明:PR10和PRP基因編碼蛋白對大豆

5、疫霉1號生理小種菌絲生長具有抑制作用，PR10基因編碼蛋白在25μg時具有明顯的抑菌效果，而PRP基因編碼蛋白在35μg時具有明顯的抑菌效果。PR10蛋白所特有的P-Loop結構域具有核苷酸酶活性，可以便RNA降解。PRP基因也具有核酸酶活性，可以降解RNA。
　　 2.構建了GFP融合表達載體pCAMBIA1302-PR10和pCAMBIA1302-PRP，利用農桿菌介導法侵染洋蔥表皮細胞，在激光共聚焦顯微鏡下觀察結果表明PR

6、10和PRP基因表達蛋白主要分布在細胞質中。
　　 3.對本課題組已獲得的轉PR10和PRP基因T1代煙草進行檢測，經(jīng)PCR檢測，獲得陽性植株6株，轉PR10和PRP基因的各3株。利用離體葉片接種法對煙草陽性植株接種煙草疫霉，結果證實轉基因煙草的抗病性較對照煙草增強。
　　 4.以感病大豆品種“東農50”的子葉節(jié)為外植體，通過農桿菌介導法對pCAMBIA3301-PR10和pCAMBIA3301-PRP進行遺傳轉化。獲得