幼年新西蘭白兔損傷關(guān)節(jié)軟骨再生相關(guān)基因cDNA差示文庫構(gòu)建及部分相關(guān)基因分析.pdf

1、研究背景：關(guān)節(jié)軟骨損傷后的修復(fù)一直是醫(yī)學(xué)界面臨的難題之一，關(guān)節(jié)軟骨損傷后不能得到良好修復(fù)及功能恢復(fù)的關(guān)鍵問題在于：目前尚無有效的方法使損傷部位形成永久性的透明軟骨關(guān)節(jié)面。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，軟骨細(xì)胞在特定的環(huán)境下可以去分化為成軟骨細(xì)胞，因此，尋找軟骨細(xì)胞去分化的激活因子和誘導(dǎo)機(jī)制成為解決關(guān)節(jié)軟骨損傷后自然修復(fù)的關(guān)鍵問題。據(jù)國外文獻(xiàn)報(bào)道，幼年新西蘭白兔關(guān)節(jié)軟骨損傷后修復(fù)關(guān)節(jié)面中透明軟骨含量達(dá)80％以上，修復(fù)組織的結(jié)構(gòu)和耐久度均接近正常關(guān)節(jié)軟骨，

2、而成年新西蘭白兔關(guān)節(jié)軟骨損傷后只有少量纖維軟骨組織修復(fù)。推測在幼年和成年動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨損傷后的修復(fù)過程中，存在修復(fù)相關(guān)基因表達(dá)的差異導(dǎo)致修復(fù)結(jié)果不同。研究具有明確軟骨再生修復(fù)能力的動(dòng)物模型損傷軟骨局部早期的基因表達(dá)，有可能發(fā)現(xiàn)軟骨再生修復(fù)的關(guān)鍵基因，并進(jìn)一步研究其修復(fù)機(jī)制，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。 目的：利用抑制性消減雜交技術(shù)研究幼年新西蘭白兔膝關(guān)節(jié)軟骨損傷后差異表達(dá)基因，構(gòu)建幼年新西蘭白兔損傷關(guān)節(jié)軟骨的差減基因片斷文庫，篩

3、選克隆主導(dǎo)幼年新西蘭白兔膝關(guān)節(jié)軟骨損傷后自然修復(fù)的相關(guān)基因，為后續(xù)課題研究奠定基礎(chǔ)和研究平臺(tái)。 方法：采用一步法和PlantRNAout相結(jié)合的方法提取損傷關(guān)節(jié)軟骨組織總RNA，采用SMART與SSH相結(jié)合的方法，分離幼年新西蘭白兔損傷膝關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)過程中差異表達(dá)基因。具有親子關(guān)系的50周齡成年新西蘭雌性白兔及其子代8周齡幼年新西蘭白兔(雌雄不限)共3對。用直徑3mm鉆頭在膝關(guān)節(jié)股骨關(guān)節(jié)面背側(cè)造成直徑3mm深3mm的關(guān)節(jié)軟骨組織

4、及軟骨下骨的缺損，取損傷后4周損傷部位關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)組織作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。幼年新西蘭白兔的修復(fù)組織為Tester組，即檢測子；成年親代雌性新西蘭白兔的修復(fù)組織為Driver組，即驅(qū)動(dòng)子。用RsaⅠ酶使cDNA切割成為具有平頭末端的小片段后，將Tester分為兩份并分別在其平頭末端連上不同的接頭Adaptor1或Adaptor2R，與酶切后的Driver進(jìn)行兩輪消減雜交和兩輪抑制性PCR擴(kuò)增，富集差異表達(dá)基因，并將PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體

5、進(jìn)行T/A連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，經(jīng)藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)初步篩選，挑選陽性克隆，陽性克隆菌擴(kuò)增后建立消減cDNA文庫，PCR驗(yàn)證陽性克隆插入片斷，并送上海生物工程公司測序。測序結(jié)果通過Chromas軟件去除載體序列及插入片斷兩端的接頭序列得到EST片斷，用DNAStar5.01對EST片斷進(jìn)行分析，去除冗余的重復(fù)序列得到差顯基因片斷，并在GeneBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性檢索，反向Northern斑點(diǎn)雜交驗(yàn)證差顯基因表達(dá)情況，

6、對差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，選擇有意義的目的基因片斷進(jìn)行后續(xù)全長基因克隆和功能研究。 結(jié)果：用一步法結(jié)合plantRNAout法提取的總RNA純度高、完整性和穩(wěn)定性好，成功逆轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA。用SMART與SSH相結(jié)合的方法成功地構(gòu)建了幼年新西蘭白兔損傷關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)過程中差異表達(dá)cDNA文庫。藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)獲得223個(gè)陽性克隆菌落，隨機(jī)選擇64個(gè)克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證，90％克隆均有插入片斷。共送217個(gè)陽性克隆測序，成功測序199個(gè)。

7、測序后分析得到20個(gè)差異表達(dá)基因片斷，其中1個(gè)為單引物擴(kuò)增序列，通過同源性檢索鑒定了13個(gè)(其中包括1個(gè)載體序列和6個(gè)無意義基因，分屬于線粒體基因、核糖體基因、表達(dá)載體基因和管家基因等)，發(fā)現(xiàn)6個(gè)未報(bào)道基因片斷。反向Northern斑點(diǎn)雜交證明，20個(gè)差異表達(dá)基因片斷中有18個(gè)在幼年新西蘭白兔損傷關(guān)節(jié)軟骨組織表達(dá)，2個(gè)假陽性差顯片斷被排除。幼年新西蘭白兔損傷關(guān)節(jié)軟骨與其親代雌兔比較，特異性表達(dá)的基因有3個(gè)，均為未報(bào)道基因序列，9個(gè)基因表

8、達(dá)上調(diào)，其中包括3個(gè)未報(bào)道基因片斷。差顯基因片斷均在GeneBank登錄并獲得注冊。 結(jié)論： 1、一步法結(jié)合plantRNAout的總RNA提取方法，簡便、快速、經(jīng)濟(jì)，適合富含多糖的關(guān)節(jié)軟骨組織小量高質(zhì)量的總RNA提取。 2、用SMART和SSH相結(jié)合的辦法成功的構(gòu)建了含有199個(gè)克隆的幼年新西蘭白兔損傷關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)組織cDNA差異表達(dá)基因文庫。 3、分析文庫中的基因，發(fā)現(xiàn)幼年新西蘭白兔關(guān)節(jié)軟骨損傷后4周

9、，基因表達(dá)較成年兔明顯活躍，差異表達(dá)基因包括鈣離子結(jié)合蛋白、皮質(zhì)穩(wěn)定素4、Ⅰ型膠原α2鏈、Ⅺ型膠原α1鏈等。部分基因與軟骨細(xì)胞的新陳代謝和細(xì)胞外基質(zhì)的合成密切相關(guān)。 4、發(fā)現(xiàn)了6個(gè)未報(bào)道EST序列，在GenBank中成功注冊。 5、反向Northen斑點(diǎn)雜交提示有3個(gè)差顯EST片斷在幼年新西蘭白兔損傷關(guān)節(jié)軟骨特異性表達(dá)，而成年新西蘭白兔不表達(dá)，此部分基因很有可能是主導(dǎo)幼年新西蘭白兔關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的相關(guān)因子，進(jìn)一步研究這3條