馬鈴薯塊莖抗低溫糖化相關(guān)基因差減文庫(kù)的構(gòu)建.pdf

1、馬鈴薯是全球第四大糧食作物，亦是一種重要的高產(chǎn)經(jīng)濟(jì)作物。隨著馬鈴薯加工產(chǎn)業(yè)（炸片、炸條）的迅猛發(fā)展，加工型馬鈴薯品種的需求量逐年遞增。為了防止馬鈴薯塊莖在收獲后的發(fā)芽、縮水、病蟲(chóng)害和腐爛等，往往將塊莖進(jìn)行低溫儲(chǔ)藏（低于10℃），但是這種方法會(huì)導(dǎo)致馬鈴薯塊莖中的淀粉降解，還原糖含量急劇上升，這一現(xiàn)象被稱之為“低溫糖化”。在油炸加工過(guò)程中，還原糖與氮化合物的僅氨基酸會(huì)發(fā)生“美拉德反應(yīng)”，生成“類(lèi)黑蛋白素”，使薯片色澤變暗，味道變苦，令消費(fèi)者

2、難以接受。而有些馬鈴薯野生種卻表現(xiàn)出耐低溫糖化的特性?，F(xiàn)今關(guān)于低溫糖化現(xiàn)象的生理生化機(jī)制并不十分清楚，與耐低溫糖化相關(guān)的基因及其表達(dá)調(diào)控研究亦十分有限。本研究以耐低溫糖化的野生種（S．berthaultii）和不耐低溫糖化的栽培品種“鄂馬鈴薯1號(hào)”為材料，通過(guò)構(gòu)建差減文庫(kù)的方法，篩選出與耐低溫糖化相關(guān)的基因，為揭示馬鈴薯塊莖耐低溫糖化機(jī)理奠定基礎(chǔ)。取得的主要研究結(jié)果如下： 1．通過(guò)改進(jìn)前人的變性液配方，配合本實(shí)驗(yàn)室的抽提方法，建

3、立了一個(gè)改良的適用于多淀粉塊莖、塊根組織RNA抽提的方法。本方法結(jié)合了鹽酸胍和尿素兩種變性劑，加上高濃度的p-巰基乙醇，有效解決了內(nèi)源RNase造成的總RNA降解以及多酚氧化污染的問(wèn)題。高濃度的變性劑和樣品凍溶后迅速加入的苯酚／氯仿／異戊醇，抑制了馬鈴薯塊莖中淀粉的吸水膨脹作用，總RNA初步沉淀后用DEPC處理的水重新溶解再進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離，更加有效的去除了蛋白質(zhì)和變性液的污染。與以前的抽提方法比較，本方法經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單、有效，提取的總RN

4、A可用于后續(xù)的各種分子生物學(xué)操作。 2．采用抑制差減雜交技術(shù)（SSH），構(gòu)建了以野生種材料（CW2-1）分別在4℃（Tester）和20℃（Driverl）條件下處理5d的表達(dá)基因差減文庫(kù)（CW）；以CW2-1（Tester）和E1（Driver2）為材料，在4℃條件下處理5d的表達(dá)基因差異文庫(kù)（CE）。CW文庫(kù)庫(kù)容為1468個(gè)克隆，CE文庫(kù)為1372個(gè)克隆。 3．應(yīng)用反向Northern技術(shù)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行了初步篩選，雜交信

5、號(hào)利用凝膠分析軟件“Gel-Pro Analyzer 3.1”進(jìn)行結(jié)果分析，根據(jù)表達(dá)信號(hào)強(qiáng)弱，從文庫(kù)CW中挑選了表達(dá)強(qiáng)度大于5倍的53個(gè)克隆，文庫(kù)CE中挑選了表達(dá)強(qiáng)度大于3倍的40個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序與分析，經(jīng)GenBank中同源性檢索分析后，分別得到了29和31個(gè)基因的EST片段。生物信息比對(duì)結(jié)果顯示，半數(shù)左右的片段為未知功能基因，在文庫(kù)CW和CE分別占57％和49％。已知功能的序列在分析的EST中包括代謝相關(guān)、抗逆相關(guān)、轉(zhuǎn)錄相關(guān)、信號(hào)傳導(dǎo)

6、、能量代謝和蛋白合成。 4．采用RT-PCR途徑，對(duì)3-磷酸甘油醛脫氫酶、腺苷甲硫氨酸脫羧酶、延伸因子1-alpha、14-3-3蛋白、硫氧還蛋白和磷酸甘油酸變位酶等6個(gè)基因進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，3-磷酸甘油醛、腺苷甲硫氨酸脫羧酶、磷酸甘油酸變位酶和硫氧還蛋白在CW2-1塊莖4℃儲(chǔ)藏后的表達(dá)強(qiáng)度高于該材料20℃儲(chǔ)藏和“鄂馬鈴薯1號(hào)”塊莖4℃儲(chǔ)藏；14-3-3蛋白在CW2-1塊莖中無(wú)論在4℃儲(chǔ)藏還是20℃儲(chǔ)藏均高于“鄂馬鈴薯1號(hào)”