馬鈴薯薯形相關(guān)基因序列分析及光敏色素影響塊莖形成初步研究.pdf

1、塊莖是馬鈴薯的地下變態(tài)器官，由匍匐莖亞頂端細(xì)胞大量分裂后膨大產(chǎn)生。馬鈴薯塊莖形態(tài)建成及其與塊莖相關(guān)的性狀是馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)的重要組成部分，也是馬鈴薯塊莖發(fā)育研究的主要內(nèi)容之一。影響馬鈴薯塊莖形成的因素較多，光周期、植物激素、溫度以及離體培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)基蔗糖濃度等均是重要調(diào)控因子，而關(guān)于塊莖形狀的調(diào)控因子目前還不清楚。本研究通過(guò)對(duì)一個(gè)長(zhǎng)形薯插入突變體的側(cè)翼序列信息分析，獲得了一些控制塊莖形狀的相關(guān)基因序列，為研究塊莖形狀奠定了一定基礎(chǔ)。

2、通過(guò)基因表達(dá)分析和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，初步分析了PHYA、PHYB、PHYB2、PHYE、PHYF等5個(gè)馬鈴薯光敏色素基因與馬鈴薯試管薯形成的關(guān)系，為明確光敏色素基因在塊莖形成過(guò)程中的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)。其主要研究結(jié)果如下。
　　 長(zhǎng)形薯插入突變體的側(cè)翼序列信息分析研究以本實(shí)驗(yàn)室前期在“鄂馬鈴薯3號(hào)”(E3)為受體的轉(zhuǎn)基因系中獲得的一個(gè)編號(hào)為pCL2b-2長(zhǎng)形薯突變系為材料，在對(duì)表型的進(jìn)一步鑒定的基礎(chǔ)上，采用hiTAIL-PCR的技術(shù)

3、擴(kuò)增T-DNA插入位點(diǎn)兩側(cè)的側(cè)翼序列，并對(duì)擴(kuò)增序列進(jìn)行了信息分析。結(jié)果顯示，該突變體試管薯長(zhǎng)寬比（1.78±0.15）顯著長(zhǎng)于野生型E3號(hào)試管薯長(zhǎng)寬比（1.33±0.05）(p＜0.05);田間種植塊莖長(zhǎng)寬比為1.50±0.06，與野生型塊莖（1.29±0.06）相比差異達(dá)到顯著水平。T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列擴(kuò)增獲得了一個(gè)長(zhǎng)度為965bp的序列，除去139bp的T-DNA上RB元件5'末端序列，實(shí)際擴(kuò)增的馬鈴薯基因組序列826bp。在

4、PGSC數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)顯示，該序列與異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因(IPT)第4個(gè)內(nèi)含子的822bp片段有89％的同源性，表明該突變體的T-DNA插入異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因(IPT)內(nèi)部。進(jìn)一步分析顯示，該突變體在插入位點(diǎn)為T(mén)-DNA片段替換了StIPT第4個(gè)內(nèi)含子的317bp區(qū)段。信息分析表明，該基因是細(xì)胞分裂素合成調(diào)控的關(guān)鍵基因，本研究將其命名為StIPT,該基因插入突變改變了塊莖形狀，暗示StIPT基因可能參與馬鈴薯薯形發(fā)育。
　　 與馬鈴

5、薯試管薯形成相關(guān)的光敏色素關(guān)鍵基因研究馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)了5個(gè)光敏色素基因。其中PHYA和PHYB與前人報(bào)道一致，其他3個(gè)光敏色素基因根據(jù)它們與相關(guān)物種的光敏色素的序列同源性，分別將它們命名為PHYB2、PHYE和PHYF。為分析5種光敏色素對(duì)光周期的響應(yīng)情況，E3試管苗在長(zhǎng)日照條件下培養(yǎng)3周后分別轉(zhuǎn)入長(zhǎng)日照(16h/d)和短日照(8h/d)培養(yǎng)2天，期間每4小時(shí)取樣以測(cè)定5種光敏色素表達(dá)水平。結(jié)果顯示，5個(gè)光敏色素基因除P

6、HYB外，其它4個(gè)都有一定的光周期節(jié)律，但對(duì)光周期的反應(yīng)不盡一致。PHYA在短日照條件下的黑暗期有明顯的表達(dá)峰，PHYB2在短日照12小時(shí)后呈現(xiàn)黑暗下表達(dá)上升，而光照下表達(dá)下降的趨勢(shì)。PHYE和PHYF在兩種光周期條件下表達(dá)模式一致，但PHYE表現(xiàn)出明顯的光周期節(jié)律，光照的前4小時(shí)表達(dá)上升達(dá)到一個(gè)峰值，而后下降至黑暗下表達(dá)最低。而PHYF表現(xiàn)出時(shí)間節(jié)律，每24小時(shí)呈現(xiàn)兩個(gè)峰值，沒(méi)有光照和黑暗的區(qū)別。
　　 為了研究5個(gè)光敏色素基

7、因是否與馬鈴薯試管薯形成有關(guān)，實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了它們的RNAi干涉載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)化E3，共獲得了151個(gè)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系?；虮磉_(dá)分析顯示，干涉效率最高達(dá)98％，但也有部分株系完全沒(méi)有干涉效果。5個(gè)基因的轉(zhuǎn)基因干涉株系分別挑選不同干涉效果的3-5個(gè)株獨(dú)立株系，在長(zhǎng)短日照下培養(yǎng)60天，統(tǒng)計(jì)結(jié)薯率。結(jié)果顯示，PHYB和PHYF干涉株系長(zhǎng)日照條件下的結(jié)薯率比對(duì)照E3提高。結(jié)果表明PHYB和PHYF可能參與光周期調(diào)控馬鈴薯塊莖形成的過(guò)