山藥不同基因型地下塊莖糖類和酚類物質(zhì)形成、調(diào)控及相關(guān)基因分離的研究.pdf

1、本研究以‘紫小’、‘紫大’、‘白扁’、‘白柱’、‘普通’、‘野生’等六種山藥基因型為材料，首先，應(yīng)用山藥形態(tài)特征多態(tài)性、地下塊莖可溶性蛋白多態(tài)性和SRAP分子標(biāo)記多態(tài)性對(duì)它們進(jìn)行分類評(píng)價(jià)；其次，運(yùn)用生理生化手段對(duì)它們地下塊莖主要糖類和酚類物質(zhì)的含量及其形成的主要酶活性進(jìn)行了測(cè)定和比較，同時(shí)，利用分子生物學(xué)技術(shù)從六種基因型地下塊莖中分離了編碼這些主要酶結(jié)構(gòu)基因的cDNA序列，其中重點(diǎn)對(duì)‘紫小’的相關(guān)基因全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行了克隆和描述；最

2、后，運(yùn)用生理生化手段分析了‘紫小’、‘白扁’和‘普通’分別經(jīng)0.5、1.0、5.0mmol·L-1的SA葉噴后地下塊莖主要糖類和酚類物質(zhì)的含量及其形成的主要酶活性：此外，還初步分析了山藥糖類和酚類物質(zhì)形成的可能關(guān)系。通過(guò)上述研究，獲得了以下主要結(jié)果： (1)形態(tài)學(xué)特征多態(tài)性、地下塊莖可溶性蛋白多態(tài)性和SRAP分子標(biāo)記多態(tài)性等三種方法都能以鑒別率為100％的效果將六種山藥基因型完全區(qū)分為結(jié)果相同的3類；‘紫小’、‘紫大’、‘白扁’

3、、‘白柱’屬于山藥田薯種(D.alataL.)，其中還可分為田薯紫色類型和田薯白色類型，前者包括‘紫小’和‘紫大’，后者包含‘白扁’和‘白柱’；‘普通’和‘野生’分別屬于普通山藥(D.oppositeThunb.)和日本山藥(D.japonicaThunb.)。比較這三種分類方法，它們的多態(tài)性比率依次為65.45％、67.70％、89.32％，基因型間的遺傳相似性系數(shù)為0.63～0.96、0,54～0,94、0.36～0.73，遺傳距離

4、為0.04～0.37、0.06～0.46、0.27～0.64，其中4個(gè)田薯的平均遺傳距離分別是0.11、0.15、0.39，這些結(jié)果表明SRAP分子標(biāo)記對(duì)上述六種基因型的分類更精細(xì)，更適用于山藥種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析和分類。 (2)六種山藥基因型地下塊莖干物質(zhì)都一直增加，其中田薯白色類型最早積累，‘普通’最遲；AM、AP、Cel和TSS構(gòu)成地下塊莖DW的50％以上，其中僅AM、AP收獲時(shí)分別占DW的28.3％～39.1％、34

5、.7％～43.7％：AM、AP的演進(jìn)總趨勢(shì)和DW的一樣，但Cel、TSS、Suc、TRS、Glc、Frc、TS表現(xiàn)相反；盡管‘野生’的DW、各種可溶性糖、Cel含量都為最小，但是在DC、TS、AM、AP的含量在盛中期前為最大；‘普通’在盛中期前TS、AM和AP的含量最低，但是收獲時(shí)最大：田薯除Suc含量一直最大外，其他糖類物質(zhì)含量介于‘普通’和‘野生’間：與可溶性糖和AM相反，DW、TS、AP和Cel在田薯白色品種中較在紫色品種中有更多

6、的含量。SAI、IAI和NI的活性總趨勢(shì)都是降低，而SuSy增至盛期最大后再降低：轉(zhuǎn)化酶活性都低于SuSy活性，尤其塊莖形成初期后；在整個(gè)取樣時(shí)期里，與SAI相反，NI和IAI的活性在‘普通’和‘野生’中高過(guò)在田薯中：SuSy活性在‘野生’中都為最低，雖然在塊莖形成初期田薯都大于‘普通’，但‘普通’收獲時(shí)達(dá)最大；與IAI、SuSy相反，SAI、NI在田薯紫色品種中的活性大于田薯白色品種的。AGPase、SSS的活性演進(jìn)模式在同基因型中相

7、似，即‘普通’的一直遞增，而其他基因型的增至塊莖形成初期或盛期最大后再減至收獲；GBSS、SBE的活性變化總趨勢(shì)在各基因型中均隨生育進(jìn)程而增加，其中在‘普通’、‘野生’中一直遞增，雖然田薯在塊莖盛后期前也一直遞增，但此后SBE與GBSS不同，表現(xiàn)稍有減少。各時(shí)期AGPase、SSS、GBSS、SBE的活性在‘野生’中都是最低，在初期雖然‘普通’小于‘田薯’，但后期則反之；除SBE外，其他三種酶都是田薯的白色品種大于紫色品種。上述除Cel

8、外的糖類化合物含量和相關(guān)酶活性在田薯類型內(nèi)都是‘紫大’大于‘紫小’和‘白扁’大于‘白柱’。方差分析結(jié)果顯示上述生理生化指標(biāo)在種間和田薯類型間大多數(shù)時(shí)期差異顯著，但是在田薯類型內(nèi)大多數(shù)時(shí)期不顯著。 (3)設(shè)計(jì)三對(duì)簡(jiǎn)并引物和一些特異引物，運(yùn)用傳統(tǒng)RT-PCR和RACE技術(shù)從六種基因型山藥地下塊莖中都能克隆到SuSy、AGPase和sss的同源基因cDNA片段，而且三者在各基因型的長(zhǎng)度分別為830bp、784bp和1104bp，可推定

9、編碼276、261和367個(gè)氨基酸，分別利用這三類同源基因的cDNA序列片段進(jìn)行同源性比對(duì)和系統(tǒng)聚類分析，結(jié)合前面基因型分類結(jié)果顯示，SuSy、AGPase、SSS同源基因的分子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系一定程度上能反映了山藥六種基因型間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近和進(jìn)化的快慢。 (4)用0、0.5、1.0、5.0mmol·L-1的SA在山藥地下塊莖形成初期和盛后期對(duì)‘紫小’、‘白扁’和‘普通’進(jìn)行葉噴后，通過(guò)對(duì)TSS、Suc、Glc、Frc、TS、AM、

10、AP、Cel的含量和SuSy、AGPase、GBSS的活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示0.5mmol·L-ISA提高了所試山藥基因型葉片合成Suc及其通過(guò)莖基部的量，從而提高了地下塊莖除Cel外的所測(cè)生理生化參數(shù)的含量，尤其在塊莖形成初期葉噴效果明顯，5.0mmol·L-1則反之，而1.0mmol·L-1在2個(gè)田薯品種中顯現(xiàn)抑制，在‘普通’中表現(xiàn)促進(jìn)：同基因型所測(cè)參數(shù)年間差異大多數(shù)不顯著；在各基因型中雖然1.0mmol·L-1的相關(guān)參數(shù)與對(duì)照的差

11、異也多不顯著，但是0.5、5.0mmol·L-1和對(duì)照的差異大多數(shù)顯著，而且同SA濃度基因型間也基本顯著。 (5)設(shè)計(jì)—對(duì)簡(jiǎn)并引物和一些特異引物，運(yùn)用普通PCR、RACE和TAIL-PCR技術(shù)，從六種基因型山藥地下塊莖中都能克隆到PAL同源基因cDNA的中間片段序列，利用這些序列進(jìn)行同源性比對(duì)和系統(tǒng)分析，結(jié)合前面基因型分類結(jié)果顯示，雖然可以將‘野生’、‘普通’和田薯的PAL同源基因區(qū)分開(kāi)來(lái)，但是田薯4個(gè)品種得不到很好的分類，所以

12、該基因不適合用來(lái)評(píng)價(jià)山藥基因型的系統(tǒng)進(jìn)化。 (6)設(shè)計(jì)兩對(duì)簡(jiǎn)并引物和一些特異引物，運(yùn)用傳統(tǒng)RT-PCR和RACE技術(shù)從六種基因型山藥地下塊莖中都能克隆到CHS和ANS的同源基因cDNA片段，兩者在各基因型的長(zhǎng)度分別為800bp、280bp，可推定編碼273、93個(gè)氨基酸，分別利用這兩類同源基因的cDNA序列片段進(jìn)行同源性比對(duì)和系統(tǒng)聚類分析，與前面基因型分類結(jié)果相比顯示，盡管CHS同源基因的分子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系一定程度上能反映了山藥六

13、種基因型間親緣關(guān)系，但是ANS同源基因不適合。 (7)在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，TFD、TPA和TTN是山藥地下塊莖TPC的主要三大構(gòu)成，分別是總酚的0.64～0.93、0.10～0.25、0.06～0.22，其中TAN和TFL構(gòu)成大部分TFD；TAN、TFL在田薯紫色類型中分別占TFD的0.53～0.75、0.13～0.34，占TPC的0.49～0.68、0.11～0.29，而在其他基因型中則分別占TFD的0,02～0.18、0.

14、55～0.86，占TPC的0.02～0.12、0.38～0.62；這些酚類化合物總變化趨勢(shì)與干物質(zhì)和淀粉變化趨勢(shì)相反，隨生育進(jìn)程而下降，但是和TAC有密切協(xié)同性；田薯紫色類型含有高于其他基因型的TPC、TFD，其次是‘普通’和田薯白色類型，‘野生’最低；盡管田薯紫色類型仍含有最高的TAN，但是其TFL和TPA的含量?jī)H稍大于‘野生’，反而是‘普通’和田薯白色類型有相對(duì)較高的TFL和TPA，說(shuō)明山藥地下塊莖TPA和TFD及TAN和TFL有著

15、競(jìng)爭(zhēng)性的積累關(guān)系；這些酚類化合物在山藥種間和田薯類型間差異也在大多數(shù)時(shí)期差異顯著，但是在田薯類型內(nèi)多數(shù)時(shí)期不顯著。PAL、ANS的酶活性不但在變化趨勢(shì)上而且在基因型比較結(jié)果上都類似于TPC、TAN。 不同濃度SA對(duì)‘紫小’、‘白扁’和‘普通’的酚類化合物和相關(guān)酶的活性在變化總趨勢(shì)上沒(méi)有顯著影響，但在葉噴后30天左右對(duì)這些生理參數(shù)的大小有一定作用，而且對(duì)各酚類化合物的含量及PAL和ANS的活性都是平行協(xié)同影響，其中0.5mmol·

16、L-1SA有促進(jìn)作用，5.0mmol·L-1則反之，而1.0mmol·L-1在田薯中顯現(xiàn)抑制，在‘普通’中表現(xiàn)促進(jìn)；‘紫小’、‘白扁’和‘普通’的酚類化合物及其相關(guān)酶活性不但年間大多數(shù)時(shí)期差異顯著，而且同處理基因型間的差異都顯著，同基因型不同處理間的差異也多顯著。同基因型的淀粉與各種酚類物質(zhì)、PAL和ANS的酶活性極顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明酚類物質(zhì)和淀粉在形成時(shí)對(duì)蔗糖提供的碳素存在著競(jìng)爭(zhēng)：酚類物質(zhì)、PAL和ANS也受到蔗糖的調(diào)控，而且蔗糖作為信