山藥塊莖發(fā)育生理生化變化及基因表達(dá)差異的研究.pdf

1、山藥(Dioscorea opposita Thunb.)屬薯蕷科(Dioseoreaceae.)薯蕷屬(Dioscorea L.)，為一年生或多年生纏繞蔓性草質(zhì)藤本植物，其地下形成肉質(zhì)肥厚根狀莖或塊莖，是山藥主要商品器官，它既可以食用也可以藥用。山藥塊莖含有淀粉、蛋白質(zhì)、糖類、維生素、尿囊素、皂苷、膽甾醇、多糖以及蛋白質(zhì)的復(fù)合體-粘液質(zhì)等物質(zhì)，具有補(bǔ)脾健胃、補(bǔ)肺止咳、固腎、滋陰壯陽(yáng)、益精、駐容延年、抗癌、防治糖尿病等功效。由于山藥不開(kāi)

2、花或者花而不結(jié)實(shí)，給通過(guò)雜交育種技術(shù)進(jìn)行品種遺傳改良帶來(lái)相當(dāng)難度。同時(shí)，山藥塊莖深埋在土壤中，難以進(jìn)行實(shí)時(shí)定位觀察和測(cè)定。因此，對(duì)山藥塊莖生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制還知之不多。本研究采用山藥定向栽培技術(shù)，對(duì)山藥塊莖發(fā)育過(guò)程中物質(zhì)積累及其相關(guān)酶活性變化、基因差異表達(dá)等進(jìn)行研究。主要結(jié)果如下：
　　 1、廣西山藥種質(zhì)資源遺傳多樣性
　　 對(duì)收集到12份廣西山藥種質(zhì)進(jìn)行種植和生物學(xué)性狀觀察。結(jié)果表明，廣西山藥種質(zhì)資源多態(tài)性豐富，15個(gè)形態(tài)指

3、標(biāo)各具多樣性；應(yīng)用形態(tài)標(biāo)記方法，將它們分成普通山藥和田薯兩個(gè)類群(歐氏距離為14-25間)；結(jié)合形態(tài)標(biāo)記與生態(tài)學(xué)特征，又可將它們分成四個(gè)類群(歐氏距離為12-14間)：北方山藥、南方山藥、野生山藥、田薯。本文參試材料桂淮5和桂淮16分屬普通山藥、田薯，具有代表性。
　　 2、初步揭示山藥塊莖形態(tài)發(fā)育規(guī)律
　　 通過(guò)實(shí)時(shí)觀測(cè)，發(fā)現(xiàn)山藥塊莖各種形態(tài)與塊莖發(fā)育顯著相關(guān)，它們隨著塊莖發(fā)育時(shí)間變化而表現(xiàn)出一定的節(jié)奏性，每個(gè)形態(tài)指標(biāo)

4、發(fā)育總體均呈“S”型發(fā)育規(guī)律，并且各個(gè)指標(biāo)發(fā)育是同步的。t檢驗(yàn)表明，采收后不同品種間的莖寬、莖重、莖體積等指標(biāo)差異極顯著，莖長(zhǎng)差異不顯著，說(shuō)明不同形態(tài)指標(biāo)遺傳改良潛力不同，以體積大小改良潛力最大，塊莖長(zhǎng)度最小。但品種間有差別，大型品種以改良莖長(zhǎng)來(lái)提高莖重比莖寬更為顯著，相反小型品種以莖粗更有效。
　　 3、不同品種山藥塊莖采收期代謝物質(zhì)含量及其相關(guān)性
　　 采用多變量統(tǒng)計(jì)方法，比較3份山藥材料(桂淮2、桂淮5、桂淮16)

5、采收期塊莖中14個(gè)代謝產(chǎn)物含量及其相關(guān)性。結(jié)果表明，桂淮16的水分、可溶性糖、蔗糖、蘋(píng)果酸、酒石酸、皂苷及可滴定酸的含量顯著高于桂淮2、5，還原糖、可溶性蛋白質(zhì)含量顯著低于桂淮2、5。蘋(píng)果酸、酒石酸、可滴定酸等酸類物質(zhì)之間顯著相關(guān)，其它物質(zhì)之間相關(guān)性在品種間有差異。3品種中14個(gè)代謝產(chǎn)物可由4個(gè)公因子分別反映98.15%、93.11%、94.03%信息量，酸類物質(zhì)是各品種第1公因子，其余公因子在品種間影響力不一致。由此表明，不同品種山藥

6、代謝產(chǎn)物的含量、相關(guān)性、關(guān)鍵因子有差異，從而形成不同品質(zhì)效應(yīng)，酸類物質(zhì)在山藥塊莖采收期物質(zhì)代謝和品質(zhì)形成中起關(guān)鍵作用。
　　 4、山藥塊莖物質(zhì)積累及相關(guān)酶活性變化對(duì)塊莖發(fā)育影響
　　 隨著山藥塊莖發(fā)育進(jìn)程的推進(jìn)，塊莖長(zhǎng)度及干物質(zhì)積累持續(xù)增加，淀粉酶(AMY)活性降低；多數(shù)碳水化合物、功能性物質(zhì)及過(guò)氧化物酶(POD)、酸性轉(zhuǎn)化酶(AI)和蔗糖磷酸合酶(SPS)活性先持續(xù)增加，達(dá)到峰值后下降，但峰期不同；2個(gè)品種的還原糖、A

7、DPG焦磷酸化酶(AGPase)變化不一致。t檢驗(yàn)表明，在塊莖發(fā)育全過(guò)程中，品種間的干物質(zhì)、淀粉、皂苷差異顯著?？扇苄蕴?、AGPase、還原糖與蔗糖顯著相關(guān)；多糖、Vc、皂苷與淀粉顯著相關(guān)；干物質(zhì)、AMY、AGPase、蛋白質(zhì)與塊莖伸長(zhǎng)膨大顯著相關(guān)。由此表明，蔗糖積累、SPS和AI活性在山藥塊莖發(fā)育中起關(guān)鍵調(diào)控作用，主要功能性物質(zhì)彼此間密切相關(guān)。
　　 5、塊莖發(fā)育過(guò)程中山藥葉片碳水化合物代謝變化
　　 可溶性糖積累及蔗

8、糖酸性轉(zhuǎn)化酶活性變化在葉片碳水化合物代謝中起主導(dǎo)作用，多數(shù)碳水化合物代謝在塊莖發(fā)育前期持續(xù)增加，中期達(dá)到高峰后下降。干物質(zhì)、還原糖、ADPG焦磷酸化酶、蛋白質(zhì)與塊莖長(zhǎng)度顯著相關(guān)。桂淮5過(guò)氧化物酶活性全程均值顯著高于桂淮16，以及塊莖發(fā)育中期至后期，桂淮5蔗糖磷酸合成酶、轉(zhuǎn)化酶、淀粉酶等分別比桂淮16高1.52倍、1.45倍和2.33倍，而AGPase低1.7倍，說(shuō)明桂淮5比桂淮16“源”強(qiáng)。進(jìn)入枯葉期，桂淮5葉片中蔗糖、可溶性糖、淀粉繼

9、續(xù)下降，而桂淮16不降反升，且桂淮5碳水化合物積累峰值與后期最小值差值比桂淮16大，表明說(shuō)明桂淮5比桂淮16“源流”大?？梢?jiàn)，說(shuō)明山藥葉“源”碳水化物代謝規(guī)律與塊莖“庫(kù)”發(fā)育進(jìn)程是協(xié)調(diào)一致的關(guān)系，品種間葉片碳水化物代謝差異影響到塊莖發(fā)育進(jìn)程。
　　 6、成功構(gòu)建山藥塊莖不同發(fā)育階段SSH文庫(kù)
　　 利用抑制消減雜交技術(shù)(SSH)成功構(gòu)建了山藥塊莖發(fā)育前期和中期cDNA的抑制消減文庫(kù)，文庫(kù)質(zhì)量能夠滿足下一步實(shí)驗(yàn)的要求。正向

10、消減文庫(kù)包括1500個(gè)cDNA克隆，反向消減文庫(kù)包括1000個(gè)cDNA克隆，cDNA片段的長(zhǎng)度分布在200-800bp左右，平均長(zhǎng)度約500bP左右，消減雜交可將18S rRNA對(duì)照基因減弱了215倍以上。
　　 7、獲得山藥塊莖不同發(fā)育階段基因差異表達(dá)譜
　　 通過(guò)對(duì)cDNA文庫(kù)生物信息學(xué)分析，獲得山藥塊莖發(fā)育前期與中期基因差異表達(dá)譜(基因表達(dá)種類和豐度信息)。
　　 隨機(jī)挑取獲得107個(gè)唯一序列，分為9大類，

11、包括細(xì)胞防御基因(22個(gè)，占20.6%)、未知功能基因(6個(gè)，占5.6%，包括推測(cè)基因)、光呼吸作用(1個(gè)，占0.9%)、生物合成(5個(gè)，占4.7%)、細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)(15個(gè)，占14.0%)、生物學(xué)徑途(12個(gè)，占11.2%)、分子功能(12個(gè)，占11.2%)、信號(hào)傳導(dǎo)(5個(gè)，占4.7%)、發(fā)育調(diào)控(29個(gè)，占27.1%)。差異表達(dá)基因主要定位于細(xì)胞核、葉綠體和細(xì)胞質(zhì)，前期文庫(kù)主要定位于葉綠體，中期文庫(kù)主要定位于細(xì)胞核；表達(dá)差異基因中，有

12、5個(gè)克隆有信號(hào)肽蛋白，2個(gè)克隆有信號(hào)錨定蛋白。
　　 8、挖掘到與山藥塊莖發(fā)育、功能性物質(zhì)及植物細(xì)胞防御等功能相關(guān)的基因
　　 通過(guò)Blast同源性比對(duì)、SBASE功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)、WoLF PSORT亞細(xì)胞定位和SignalP信號(hào)肽分析等生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明：(1)鋅指蛋白、泛素-連接酶體、碳酸酐酶、EGF-like、NDPK蛋白、氨基酸通透酶、鈣調(diào)素結(jié)合蛋白、纖維素合酶等基因在山藥塊莖發(fā)育中期上調(diào)，BTB蛋白等基因

13、在山藥塊莖發(fā)育中期下調(diào)，它們多與植物塊莖發(fā)育相關(guān)，但參與植物生長(zhǎng)物質(zhì)代謝相關(guān)基因出現(xiàn)頻率較高。(2)山藥塊莖發(fā)育過(guò)程中，涉及到大量與物質(zhì)合成代謝相關(guān)基因差異表達(dá)，尤其與次生代謝物質(zhì)合成和運(yùn)輸基因更為顯著，包括：ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、糖基轉(zhuǎn)移酶、GDP-甘露糖焦磷酸化酶等在山藥塊莖發(fā)育中期上調(diào)，α-淀粉酶等在山藥塊莖發(fā)育中期下調(diào)。(3)在山藥發(fā)育進(jìn)程中，伴隨著大量與植物細(xì)胞防御有關(guān)基因的差異表達(dá)，共同參與植物抗逆境反應(yīng)，包括酪蛋白激酶、EPSP