抑制馬鈴薯Acid Invertase基因表達(dá)對(duì)塊莖淀粉-糖代謝的影響研究.pdf

1、馬鈴薯是世界第四大糧食作物，用途廣泛，其加工產(chǎn)品炸片和炸條是重要的油炸食品。為了抑制常溫貯藏產(chǎn)生的塊莖失水皺縮、病害傳播、發(fā)芽等現(xiàn)象及延長(zhǎng)加工周期，通常將馬鈴薯塊莖貯藏在低溫條件下。但低溫常使塊莖中的淀粉加速轉(zhuǎn)化為還原糖，高溫油炸加工時(shí)，還原糖與塊莖中游離的氨基酸發(fā)生褐化反應(yīng)，嚴(yán)重影響油炸產(chǎn)品的色澤和品質(zhì)，甚至對(duì)人體健康產(chǎn)生不良影響。因此，控制“低溫糖化”已經(jīng)成為馬鈴薯采后生理學(xué)研究的熱點(diǎn)。塊莖“低溫糖化”是個(gè)復(fù)雜的數(shù)量性狀，涉及淀粉.

2、糖代謝的多種路徑，調(diào)節(jié)和反饋因子多，因此“低溫糖化”的機(jī)理研究是馬鈴薯加工品質(zhì)改良的重要基礎(chǔ)工作。在植物體內(nèi)，蔗糖降解只有兩個(gè)途徑：蔗糖合成酶途徑和轉(zhuǎn)化酶途徑。轉(zhuǎn)化酶，又稱(chēng)蔗糖轉(zhuǎn)化酶，可分為中性(或堿性)轉(zhuǎn)化酶和酸性轉(zhuǎn)化酶，其中，酸性轉(zhuǎn)化酶又包括液泡轉(zhuǎn)化酶和胞壁轉(zhuǎn)化酶。前人的研究表明，酸性轉(zhuǎn)化酶活性與還原糖/蔗糖比率成顯著正相關(guān)，從而成為淀粉一糖代謝中的關(guān)鍵酶之一。因此，進(jìn)一步明確轉(zhuǎn)化酶在調(diào)控馬鈴薯低溫糖化過(guò)程中的作用，對(duì)于馬鈴薯淀粉一

3、糖代謝的調(diào)控進(jìn)而提高馬鈴薯低溫貯藏下的加工品質(zhì)具有重要的理論和實(shí)踐意義。 本研究旨在克隆馬鈴薯內(nèi)源酸性轉(zhuǎn)化酶基因，并通過(guò)構(gòu)建組成型啟動(dòng)子CaMV35S和塊莖特異表達(dá)啟動(dòng)子CIPP驅(qū)動(dòng)的反義基因(或片段)載體以及RNA干涉載體轉(zhuǎn)化馬鈴薯，對(duì)內(nèi)源酸性轉(zhuǎn)化酶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)一步明確其在淀粉一糖代謝過(guò)程中的作用，揭示酸性轉(zhuǎn)化酶在調(diào)控馬鈴薯低溫糖化中的關(guān)系。主要結(jié)果如下： 1.以發(fā)表的酸性轉(zhuǎn)化酶基因的序列設(shè)計(jì)引物，采用RT-

4、PCR的方法，從低溫處理的馬鈴薯品系JH塊莖eDNA中克隆到全長(zhǎng)為1920bp的特異條帶，DNA序列測(cè)定結(jié)果顯示，目標(biāo)片段為inv的完整的編碼序列，為一個(gè)開(kāi)放讀碼框，編碼639個(gè)氨基酸。Blasm結(jié)果顯示，該片段與已知的酸性inv基因cDNAS70040(番茄)以及液泡轉(zhuǎn)化酶cDNA X70368.1(馬鈴薯)、Z12025(番茄)和Z12026(醋栗番茄)的同源性分別達(dá)到95％，98％，96％和96％。其中，Expasy蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的

5、結(jié)果顯示，氨基酸序列的34到56有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域KIISGIFLSSFLLSVAFFPILN，同時(shí)，在N端1-49存在一個(gè)信號(hào)結(jié)構(gòu)，在614的位置存在一個(gè)蛋白剪切位點(diǎn)GAS，120-124和299-303為inv基因的兩個(gè)保守位點(diǎn)NDPNG和WECVD，在靠近N端的序列中還存在幾處糖基化位點(diǎn)。上述結(jié)果初步證明，所克隆的cDNA為馬鈴薯液泡轉(zhuǎn)化酶基因，該序列已經(jīng)在GenBank注冊(cè)，登記號(hào)為AY341425。 2.通過(guò)PCR.擴(kuò)增

6、和限制酶切，將克隆的cDNA分為靠近5’端(397bp)，包含有保守位點(diǎn)的中間區(qū)段(625bp)以及靠近3’端(955bp)的三個(gè)片段。四個(gè)片段(包括全長(zhǎng))分別與35S和CIPP啟動(dòng)子構(gòu)建成反義載體轉(zhuǎn)化馬鈴薯。對(duì)轉(zhuǎn)基因塊莖進(jìn)行低溫貯藏(設(shè)置常溫貯藏對(duì)照)后測(cè)定酸性轉(zhuǎn)化酶活性和還原糖含量，結(jié)果顯示，不同插入片段大小對(duì)酶活性和還原糖含量的影響沒(méi)有顯著差異。其中，35S啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因株系中，低溫(4℃)貯藏下，酸性轉(zhuǎn)化酶活性2005年的平均下

7、降幅度從為29％-47％，2006年平均降幅為10％-13％；還原糖含量2005年的平均降幅為19％-26％，2006年為29％-34％。室溫(20℃)貯藏下，2005年的酸性Inv活性降幅均在60％以上，但還原糖含量變化不大；而2006年的還原糖含量下降均達(dá)到30％以上，酸性Inv活性無(wú)顯著變化。兩類(lèi)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因株系的抑制效率存在顯著差異。4℃貯藏條件下，CIPP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因植株的酶活性下降53％(貯藏6周)和21％(貯藏10周

8、)，還原糖含量下降35％(貯藏6周)和67％(貯藏10周)；但是室溫貯藏條件下，不同啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因株系的平均酶活和還原糖含量都沒(méi)有明顯差異。試驗(yàn)結(jié)果證明，所使用的cDNA片段均能達(dá)到相似的反義抑制效果。而采用塊莖特異表達(dá)的CIPP啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化植株，其塊莖的酸性轉(zhuǎn)化酶活性和還原糖含量在低溫貯藏下的抑制效果均優(yōu)于組成型表達(dá)的35S啟動(dòng)子。 3.研究還構(gòu)建了RNA干涉載體并轉(zhuǎn)化馬鈴薯，并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株和試管薯進(jìn)行酸性轉(zhuǎn)化酶活性的測(cè)定。結(jié)

9、果表明，在測(cè)定的5個(gè)株系中，植株的酸性轉(zhuǎn)化酶活性均有不同程度的下降，其中除Ni-1外，酶活下降均在65％以上，最大降幅為78％(Ni-4)，平均下降59.3％。而同時(shí)測(cè)定的抑制效果較好的反義轉(zhuǎn)基因株系中，酸性轉(zhuǎn)化酶活性最大降幅為84％(ES4-3)，平均下降58.4％，表明RNAi技術(shù)在馬鈴薯抗“低溫糖化”基因工程中也同樣具有較好的應(yīng)用潛力。 4.Northern分析表明，轉(zhuǎn)基因植株和塊莖中反義RNA的表達(dá)量在不同的啟動(dòng)子之間存

10、在一定的差異，其中，35S啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)的株系在植株和塊莖中均有強(qiáng)烈的表達(dá)，CIPP啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)的株系只在塊莖中呈現(xiàn)強(qiáng)烈的表達(dá)，而在植株的表達(dá)幾乎沒(méi)有，也再次證實(shí)了CIPP啟動(dòng)子的塊莖特異性。RNA干涉的轉(zhuǎn)基因植株中內(nèi)源酸性轉(zhuǎn)化酶的mRNA表達(dá)量也明顯降低。Northern分析進(jìn)一步說(shuō)明酸性轉(zhuǎn)化酶的反義抑制和RNA干涉顯著降低了植株內(nèi)源酸性轉(zhuǎn)化酶的mRNA的表達(dá)，證明Invertase可能主要在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控塊莖低溫糖化。 5.

11、對(duì)抑制效果較好的株系進(jìn)行塊莖低溫貯藏以后，測(cè)定了其蔗糖和淀粉含量。結(jié)果表明，在低溫貯藏(4℃)條件下，株系ES4-3的抑制效率達(dá)到最高，酸性轉(zhuǎn)化酶活性降低了72％，還原糖含量下降了68.7％，同時(shí)引起蔗糖含量的上升(含量增加92.4％)和淀粉的積累(淀粉含量增加7.2％)。同時(shí)，EC4-5和EC19-5的酸性轉(zhuǎn)化酶活性也分別表現(xiàn)出33.4％和23.9％的下降，還原糖含量分別下降8.69％和69.5％，從而導(dǎo)致蔗糖含量分別增加了7.6％和

12、12.2％。總體上，轉(zhuǎn)基因株系中酸性轉(zhuǎn)化酶活性和還原糖含量的大量變化能夠引起蔗糖分解顯著降低，但對(duì)淀粉的合成并沒(méi)有明顯的促進(jìn)。在室溫貯藏(20℃)條件下，除個(gè)別株系(EC4-5)外，各測(cè)定指標(biāo)變化不大。證明低溫導(dǎo)致的塊莖還原糖積累可能主要來(lái)自于蔗糖分解途徑，而不是淀粉降解。 6.選取測(cè)定結(jié)果較好的轉(zhuǎn)基因塊莖及其非轉(zhuǎn)基因?qū)φ蘸图庸て贩N對(duì)照，低溫貯藏后進(jìn)行炸片試驗(yàn)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因塊莖的炸片色澤指數(shù)較非轉(zhuǎn)基因?qū)φ站兴档?，同一株?/p>