Zoledronic acid和Genistein對OPG基因敲除鼠骨代謝影響的研究.pdf

1、第一部分OPG基因敲除骨丟失鼠的骨微結(jié)構(gòu)及生物力學(xué)改變。 目的:觀察護(hù)骨素(OPG)基因敲除骨丟失鼠的骨微結(jié)構(gòu)、骨生物力學(xué)、骨密度、骨礦含量及骨轉(zhuǎn)換生化指標(biāo)的變化，探討OPG在骨丟失中的作用。 方法: SPF級10周齡雌性O(shè)PG基因敲除純合子(OPG<'-/->)小鼠與野生型(WT)小鼠各10只。OPG<'-/->與WT小鼠均由具有C57BL/6J×129/SV 背景的OPG雜合子(OPG<'-/->)小鼠相互交配產(chǎn)生。

2、應(yīng)用μCT測定小鼠右側(cè)脛骨近端松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨的骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)；DXA測定左側(cè)股骨骨密度；應(yīng)用三點彎曲試驗檢測右側(cè)股骨的骨生物力學(xué)性能；以ELISA法檢測血清骨源性堿性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶以及NF-κB受體活化因子配基。 結(jié)果:與野生型小鼠比較，OPG基因敲除小鼠的脛骨松質(zhì)骨體積骨密度、組織骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)、骨面積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)目及骨小梁連結(jié)密度均明顯下降，而結(jié)構(gòu)模型指數(shù)、骨小梁厚度及骨小梁間隔明顯增加；皮質(zhì)骨厚度、皮質(zhì)骨面

3、積、截面總面積、截面慣性矩、皮質(zhì)骨密度和皮質(zhì)骨骨礦含量明顯降低，內(nèi)徑周長與骨髓腔面積則明顯增加。股骨的最大載荷、最大應(yīng)力、彈性模量及剛性系數(shù)均明顯下降。股骨骨密度與骨礦含量明顯下降。血清骨源性堿性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶以及核因子κB受體活化因子配基均明顯升高。 結(jié)論: OPG基因敲除小鼠的松質(zhì)骨與皮質(zhì)骨出現(xiàn)高轉(zhuǎn)換型骨丟失，伴顯著的骨微結(jié)構(gòu)破壞和生物力學(xué)性能下降。 第二部分 Zoledronic acid抗骨吸收的作用

4、機(jī)制研究。 目的:探討在體內(nèi)環(huán)境中二膦酸鹽 Zoledronic acid 的抗骨吸收作用機(jī)制及其與OPG途徑的關(guān)系。 方法: SPF級6周齡雌性O(shè)PG基因敲除小鼠純合子(OPG<'-/->)20只隨機(jī)分為Zoledronic acid(Zol)組和溶媒對照組，另10只野生型小鼠(WT)為正常對照組。OPG<'-/->與WT 小鼠均由具有 C57BL/6J×129/SV背景的OPG雜合子(OPG<'+/->)小鼠相互交配

5、產(chǎn)生。Zol組給予Zoledronicacid 150μg/kg，皮下注射，每周2次，相應(yīng)的溶媒對照組每周2次皮下注射等容量溶媒(無菌蒸餾水)，干預(yù)時間6周。應(yīng)用μCT測定小鼠右側(cè)脛骨近端松質(zhì)骨和皮質(zhì)的骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)；DXA測定左側(cè)股骨總體骨密度與骨礦含量；三點彎曲試驗檢測右側(cè)股骨的骨生物力學(xué)性能。ELISA 法檢測血清骨源性堿性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶以及NF-κB受體活化因子配基。 結(jié)果:與H<,2>O溶媒對照組比較，Zol

6、edronic acid組的股骨總體骨密度與骨礦含量均明顯增加，達(dá)到野生型小鼠水平。股骨的生物力學(xué)參數(shù)最大載荷、最大應(yīng)力、彈性模量及剛性系數(shù)明顯升高。脛骨松質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)體積骨密度、組織骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)、骨面積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)目、骨小梁連接密度和骨小梁厚度均較溶媒對照組明顯升高，其中，組織骨密度、骨小梁連接密度、骨體積分?jǐn)?shù)和骨小梁厚度還顯著高于野生型小鼠；而結(jié)構(gòu)模型指數(shù)與骨小梁間隔則明顯降低。脛骨皮質(zhì)微結(jié)構(gòu)參數(shù)皮質(zhì)骨厚度、截面慣性矩、皮

7、質(zhì)骨面積、截面總面積、皮質(zhì)骨密度和皮質(zhì)骨礦含量均明顯增高，其中，皮質(zhì)骨厚度、皮質(zhì)骨密度和皮質(zhì)骨礦含量還顯著高于野生型小鼠；而內(nèi)徑周長與骨髓腔面積則明顯下降。血清抗酒石酸酸性磷酸酶明顯下降，血清NF-κB受體活化因子配基明顯上升，而血清骨源性堿性磷酸酶無明顯變化。 結(jié)論:在小鼠體內(nèi)OPG基因功能缺失狀況下，Zoledronic acid 仍具有良好的拮抗骨丟失作用。提示 Zoledronic acid在體內(nèi)的抗骨吸收作用并非依賴O

8、PG途徑，對破骨細(xì)胞的直接抑制可能是其抗骨吸收的主要途徑。 第三部分 Genistein 調(diào)節(jié)骨代謝的作用機(jī)制研究。 目的:探討植物雌激素Genistein在體內(nèi)對骨代謝的作用與OPG途徑之間的關(guān)系。 方法: SPF級6周齡雌性O(shè)PG基因敲除純合子(OPG<'-/->)小鼠40只隨機(jī)分為Genistein(Gen)組、17β-Estradiol組(E<,2>)組、DMSO對照組、Zoledronic acid(Z

9、ol)組及H<,2>O對照組，8只野生型(WT)小鼠為正常對照組。OPG<'-/->與WT小鼠均由具有C57BL/6J×129/SV背景的OPG雜合子(OPG<'+/->)小鼠相互交配產(chǎn)生。Gen組給予Genistein0.8mg/只/天，皮下注射。E<,2>組給予17β-Estradiol(0.03 μg/只/天)，皮下注射。相應(yīng)的溶媒對照DMSO組每天皮下注射等容量的。DMSO與聚乙二醇300混合物。Zol組給予Zoledronic

10、 acid 150μg/kg，皮下注射，每周2次，相應(yīng)的溶媒對照H<,2>O組每周2次皮下注射等容量的無菌蒸餾水。干預(yù)時間為6周。應(yīng)用μCT測定小鼠右側(cè)脛骨近端松質(zhì)骨和皮質(zhì)的骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)；DXA測定左側(cè)股骨總體骨密度與骨礦含量；三點彎曲試驗檢測右側(cè)股骨的骨生物力學(xué)性能；ELISA法檢測血清骨源性堿性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶和NF-κB受體活化因子配基。 結(jié)果:與DMSO溶媒對照組比較，Genistein組與17β-Estrad

11、iol組股骨總體骨密度與骨礦含量無增加。股骨生物力學(xué)參數(shù)最大載荷、最大應(yīng)力、彈性模量及剛性系數(shù)均無明顯變化。脛骨松質(zhì)微結(jié)構(gòu)參數(shù)骨體積骨密度、組織骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)、骨面積分?jǐn)?shù)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)、骨小梁數(shù)目、骨小梁聯(lián)接密度、骨小梁間隔及骨小梁厚度，和皮質(zhì)的骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)皮質(zhì)骨厚度、截面慣性矩、內(nèi)徑周長、外徑周長、骨髓腔面積、皮質(zhì)骨面積、截面總面積、皮質(zhì)骨密度及皮質(zhì)骨礦含量亦無改善。血清骨源性堿性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶以及NF-κB受體活化因

12、子配基水平無變化。Zoledrotlic acid則能顯著改善OPG基因敲除小鼠的骨密度、骨生物力學(xué)性能及骨微結(jié)構(gòu)，部分指標(biāo)達(dá)到甚至超過野生型小鼠水平。 結(jié)論:在小鼠體內(nèi)OPG基因功能缺失的狀況下， Genistein 與17β-Estradiol 調(diào)節(jié)骨代謝的作用完全消失，提示Genistein與17β-Estradiol 對骨代謝的作用完全依賴于OPG途徑。 第四部分 OPG轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立 目的:護(hù)骨素

13、OPG是調(diào)節(jié)骨代謝重要的細(xì)胞因子之一，為開展其在整體水平上的功能研究，建立OPG轉(zhuǎn)基因小鼠模型。 方法:構(gòu)建帶有人類OPG基因啟動子的真核表達(dá)載體 pCI-hOPGp-mOPG，以顯微注射法轉(zhuǎn)入C57BL/6J×CBA小鼠受精卵雄核中，導(dǎo)入假孕母鼠輸卵管后培養(yǎng)子代小鼠，PCR鑒定子代小鼠基因型。 結(jié)果:構(gòu)建的表達(dá)載體pCI-hOPGp-mOPG 質(zhì)粒經(jīng)酶切與測序鑒定序列正確。在69只原代小鼠中，有7只轉(zhuǎn)基因陽性的Foun