鐵調(diào)節(jié)蛋白2基因敲除對小鼠糖代謝的影響及其作用機(jī)制.pdf

1、目的：糖尿病是一種常見的全球慢性代謝紊亂性疾病。伴隨著人們生活質(zhì)量的不斷提升，糖尿病的患病率也在逐年攀升。據(jù)2010年中國非傳染性疾病監(jiān)測項(xiàng)目公布的糖尿病流行病學(xué)的調(diào)查結(jié)果顯示：我國18歲以上人群（包括18歲）糖尿病的患病率達(dá)11.6％，據(jù)此估計(jì)中國糖尿病患病人數(shù)已達(dá)1.139億，我國已然成為世界第一糖尿病大國。遺傳因素、環(huán)境因素、以及社會(huì)老齡化都是糖尿病患病率驟增的原因。近年來越來越多的證據(jù)均表明，促成2型糖尿病發(fā)病的一個(gè)重要的危險(xiǎn)因

2、素為機(jī)體內(nèi)過量的微量元素鐵。鐵是人體必需的重要微量元素，體內(nèi)存在嚴(yán)格的鐵代謝調(diào)控機(jī)制以確保體內(nèi)鐵平衡。機(jī)體內(nèi)鐵含量升高，可以導(dǎo)致包括糖尿病在內(nèi)的多種疾病。鐵調(diào)節(jié)蛋白2（IRP2）是細(xì)胞中存在的一種多肽，是鐵硫簇異構(gòu)酶中的一種，在各種細(xì)胞和組織內(nèi)均有著極豐富的表達(dá)。IRP2在鐵調(diào)節(jié)代謝過程中起重要作用，當(dāng)敲除IRP2基因后可發(fā)生組織鐵沉積。多項(xiàng)研究均表明，鐵過載與糖尿病發(fā)生密切相關(guān)，但其中具體的機(jī)制尚未完全闡明。鐵過載導(dǎo)致的糖代謝異常究竟

3、是與胰島素的分泌功能下降有關(guān)，還是與胰島素抵抗有關(guān)，國內(nèi)外未見詳盡報(bào)道。為此，我們擬通過IRP2基因敲除（IRP2-/-）構(gòu)建鐵過載小鼠模型，探討鐵過載對糖代謝的影響及其具體機(jī)制。
　　方法：隨機(jī)選取15月齡體重30g左右的C57BL/6品系健康雄性野生型(IRP2+/+組)小鼠和 IRP2基因敲除型(IRP2-/-組)小鼠各24只作為研究對象。兩組小鼠均于清潔環(huán)境中采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。分別采用葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)評估小鼠

4、胰島β細(xì)胞的儲(chǔ)備功能和胰島素敏感性；放射免疫法檢測兩組小鼠胰島素水平；原子吸收、同步輻射及免疫組化法檢測組織中鐵的沉積情況；超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）試劑盒檢測肝臟和肌肉氧化應(yīng)激水平；原位末端標(biāo)記（terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediateddUTP nick end labeling,TUN

5、EL）試劑盒檢測細(xì)胞凋亡情況；Real-time PCR和Western blot檢測肝臟組織中胰島素受體底物2（insulinreceptor substrate 2，IRS2）和肌肉組織中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4（glucose transporter，Glut4）的表達(dá)。應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有計(jì)量資料均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，正態(tài)分布數(shù)據(jù)以x±s表示，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以（最小值，最大值）表示，正態(tài)分布資料數(shù)據(jù)，采用獨(dú)立樣本t檢

6、驗(yàn)進(jìn)行比較，不符合正態(tài)分布的資料采用獨(dú)立樣本的Mann-Whitny U秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.與野生型小鼠相比，IRP2-/-小鼠血糖顯著升高（葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)各點(diǎn)血糖值：0min6.62±0.79mmol/L比5.08±0.27mmol/L,p0min=0.022；15min16.32±3.33mmol/L比13.06±0.81mmol/L,p15min=0.093；30min17

7、.64±2.71mmol/L比13.78±0.85mmol/L,p30min=0.07；60min13.96±1.61mmol/L比9.86±0.89mmol/L,p60min=0.001；120min10.90±1.67mmol/L比6.26±0.36mmol/L,p120min=0.036），胰島素敏感性顯著下降（胰島素耐量實(shí)驗(yàn)各點(diǎn)血糖值：0min6.56±0.59mmol/L比5.10±0.33mmol/L,p0min=0.001

8、；15min4.82±0.19mmol/L比4.28±0.38mmol/L,p15min=0.021；30min4.58±0.13mmol/L比2.52±0.15mmol/L,p30min=0.001；60min3.40±0.23mmol/L比2.74±0.15mmol/L,p60min=0.001；120min5.82±0.47mmol/L比4.34±0.48mmol/L,p120min=0.001），但是，空腹及第一時(shí)相胰島素分泌差

9、別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0min33.15±1.41uIU/ml比31.45±1.41uIU/ml,p0min=0.308;30min70.99±1.22uIU/ml比77.70±6.56uIU/ml,p30min=0.156)。
　　2.原子吸收及同步輻射結(jié)果顯示，與野生型小鼠相比，IRP2-/-小鼠鐵主要沉積在肝臟（540.91±131.41μg/g比270.99±64.85μg/g，p＜0.001）、骨骼肌((43.28,73.47

10、)比(28.49,57.80）μg/g，p＜0.05）以及胰腺（172.69±7.94μg/g比119.03±11.50μg/g，p＜0.001）。
　　3.胰島素免疫組化與鐵沉積普魯士藍(lán)染色，確定鐵沉積主要發(fā)生在胰島腺泡細(xì)胞，而非胰島β細(xì)胞。
　　4.與野生型小鼠相比，IRP2-/-小鼠肝臟和骨骼肌組織的SOD水平顯著下降[（0.47,0.52）比(0.49,0.63)U/mgprot，pliver＜0.001；(0.81

11、±0.11)U/mgprot比(1.00±0.13)U/mgprot，pmuscle＜0.05]，MDA水平顯著升高[(6.03±1.25)nmol/mgprot比(4.13±0.14)nmol/mgprot，pliver＜0.05；(1.38±0.20)nmol/mgprot比(1.00±0.10)nmol/mgprot，pmuscle＜0.01]，表明IRP2-/-小鼠存在氧化應(yīng)激紊亂。
　　5.IRP2-/-組小鼠肝細(xì)胞凋亡

12、信號約為IRP2+/+組小鼠的10倍，骨骼肌細(xì)胞凋亡信號約為IRP2+/+組小鼠的12倍，胰腺腺泡細(xì)胞凋亡信號約為IRP2+/+組小鼠的3倍，其凋亡細(xì)胞數(shù)與氧化應(yīng)激紊亂相關(guān)。
　　6.與野生型小鼠相比，IRP2-/-小鼠肝臟IRS2、骨骼肌Glut4 mRNA[(0.40,0.84)比(0.54,2.05)，pIRS2＜0.001；(0.01,0.82)比(0.79,1.51)，pGLUT4＜0.001]及蛋白表達(dá)水平（0.98±

13、0.24比2.48±0.19，pIRS2＜0.001；1.04±0.27比1.80±0.15，pGLUT4＜0.001）顯著降低。
　　結(jié)論：
　　1.鐵調(diào)節(jié)蛋白2基因敲除可導(dǎo)致糖代謝異常，但是，血糖升高的原因并非胰島素分泌功能受損，而是胰島素抵抗。
　　2.鐵調(diào)節(jié)蛋白2基因敲除后可以導(dǎo)致胰島素作用的靶器官（肝臟和肌肉）發(fā)生鐵沉積，后者導(dǎo)致肝臟和肌肉氧化應(yīng)激紊亂、細(xì)胞凋亡增加，肌肉Glut4和肝臟IRS2表達(dá)降低，發(fā)生