蛋白酶A敲除對(duì)釀酒酵母糖代謝及抗逆性能的調(diào)控作用機(jī)制.pdf

1、釀酒酵母蛋白酶A是釀酒酵母PEP4基因編碼，是一種天冬氨酸蛋白酶，屬于胃蛋白酶A家族。酵母液泡中的蛋白酶A能催化蛋白質(zhì)水解，特別是在氮缺乏、孢子形成時(shí)，蛋白酶A能夠通過水解蛋白質(zhì)為孢子新蛋白的合成提供氨基酸來源。在液泡中，酵母蛋白酶A參與多種酶的轉(zhuǎn)錄后加工作用，對(duì)液泡中其他液泡酶的成熟激活過程有著重要的作用。此外，目前越來越多的人對(duì)蛋白酶A在釀酒酵母細(xì)胞中發(fā)揮的獨(dú)特作用進(jìn)行了研究，也逐漸地意識(shí)到蛋白酶A在釀酒酵母細(xì)胞中發(fā)揮的重要作用。但

2、是，對(duì)于蛋白酶A在單倍體釀酒酵母細(xì)胞基礎(chǔ)代謝中的調(diào)控及其調(diào)控機(jī)制目前還研究得比較少?；诖耍P者就蛋白酶A對(duì)釀酒酵母的基礎(chǔ)代謝：糖代謝及抗逆性能的調(diào)控作用進(jìn)行了比較深入的研究。
　　 本論文研究?jī)?nèi)容主要包括以下幾個(gè)方面，分別為蛋白酶A敲除對(duì)釀酒酵母糖代謝關(guān)鍵酶酶活的影響，對(duì)糖代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的影響(采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù))，對(duì)釀酒酵母蛋白表達(dá)的影響(采用蛋白質(zhì)雙向電泳和飛行質(zhì)譜鑒定技術(shù))，對(duì)釀酒酵母抗氧化、抗輻射性的影響

3、，以及在低氮條件下蛋白酶A敲除對(duì)釀酒酵母糖代謝關(guān)鍵酶的影響。通過研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶A的敲除使得單倍體釀酒酵母細(xì)胞糖代謝中關(guān)鍵酶的比活上調(diào)，即蛋白酶A的敲除對(duì)糖代謝中六個(gè)關(guān)鍵酶的比活起到了正調(diào)控作用；蛋白酶A的敲除引起了檸檬酸合酶(CS)和a-酮戊二酸脫氫酶(a-KGDHC)基因的表達(dá)上調(diào)，己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)和異檸檬酸脫氫酶(ICD)基因表達(dá)的下調(diào)，還可能影響到這些酶的翻譯及翻譯后的相關(guān)加工修飾等過

4、程；通過蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)，參與代謝途徑最多且蛋白表達(dá)下調(diào)最為顯著的涉及到糖代謝的蛋白主要有果糖二磷酸醛縮酶(Fba1p)、烯醇化酶(En02p)和丙酮酸脫羧酶(Pdc1p)。而進(jìn)一步通過熒光定量PCR鑒定發(fā)現(xiàn)Pdc1p是受到蛋白酶A影響最為明顯的糖代謝酶。結(jié)合酵母細(xì)胞的代謝流程圖可以推斷蛋白酶A的敲除可以影響到酵母細(xì)胞的整個(gè)生化代謝途徑；在低氮條件下，蛋白酶A的敲除使得菌株較早地發(fā)生自溶或者裂解，從而使胞內(nèi)外蛋白含量均發(fā)生變化，同時(shí)菌