同源重組技術構建蛋白酶A低表達且能產(chǎn)β-葡聚糖酶的釀酒酵母菌株及其性能研究.pdf

1、β—葡聚糖在啤酒生產(chǎn)中會造成過濾困難以及成品啤酒的非生物性混濁等問題，一定程度上影響啤酒的質量和保質期。啤酒泡沫，特別是純生啤酒的泡沫問題會受到蛋白酶A(PrA)很大程度的影響。現(xiàn)代啤酒工業(yè)中通過生產(chǎn)過程中添加微生物來源的β—葡聚糖酶制劑以及PrA的抑制劑等手段來降低它們帶來的消極影響，但這無疑使啤酒生產(chǎn)變得復雜而且提高了成本。因此，本研究采用同源重組技術以枯草芽孢桿菌的β—葡聚糖酶基因替換釀酒酵母染色體組中的一個PEP4等位基因，構建

2、能夠降解β—葡聚糖而PrA低表達的重組釀酒酵母。結果表明，構建的重組菌株能有效的分泌β—葡聚糖酶同時降低了PrA的表達，在刪除了進行基因操作時引入的抗性標記基因后，構建完成了適合于啤酒工業(yè)特別是純生啤酒釀造的重組釀酒酵母菌株。同時對重組釀灑酵母菌株的生理和發(fā)酵性能進行了研究。主要研究結果如下：
　　 從釀酒酵母基因組中PCR擴增PGK1啟動子、MFα1信號肽以及ADH1終止子序列，構建了在釀酒酵母的啟動子、分泌序列、終止子作用下

3、的枯草芽孢桿菌bglS基困(編碼β—1，3—1，4—葡聚糖酶)在釀酒酵母中的表達單元。并以KanMX自kanr為篩選標記，以質粒Yeplac181為出發(fā)質粒構建了釀酒酵母的表達載體。表達載體中包含的bglS表達單元轉入工業(yè)釀酒酵母菌株WZ65得到了表達，并得到了有效分泌。用DNS法對重組酵母菌生長過程中分泌到培養(yǎng)介質中的β—葡聚糖酶活性進行了測定，結果顯示在60h出現(xiàn)最大值，然后下降，在接下來的60h內基本保持穩(wěn)定。
　　 在前

4、人研究的基礎上對β—葡聚糖酶活性測定方法進行改進，用剛果紅法可以更好的對本文構建的重組釀酒酵母菌株分泌的β—葡聚糖酶酶活進行測定。對重紐酶的酶學性質進行了研究，并與枯草芽孢桿菌中表達的野生型β—葡聚糖酶的性質進行了對比。研究發(fā)現(xiàn)，本試驗構建的重組酵母表達的重組β—葡聚糖酶酶學性質發(fā)生了改變。40℃熱處理20min造成重組酶活很大損失，殘留的酶活只有30℃處理的63.4％；70℃的熱處理與40℃處理相比酶活性只降低了17.5％，保持了45

5、.9％的最初酶活，重組酶在高溫下的穩(wěn)定性增強。與野生酶相比，重組酶的最適pH值為5.0，而野生酶在6.0—7.0之間；相比野生酶在pH6.0—7.0有較高的穩(wěn)定性，重組酶在pH5.0—6.0之間有最大的穩(wěn)定性。
　　 由于釀酒酵母中表達載體不穩(wěn)定，為了使β—葡聚糖酶在重組酵母菌株更穩(wěn)定的表達而且降低蛋白酶A對啤灑泡沫陽性蛋白的降解作用，在前期試驗證明了構建的bglS表達單元正確的基礎上，用bglS基因表達單元替換了出發(fā)酵母菌株W

6、Z65染色體上的一個PEP4等位基因，構建了PEP4等位基因雜合的重組釀酒酵母菌株SC—βG1、SC—βG2，其基因型為：PEP4/pep4：：KanMX—bglS。β—1，3—1，4—葡聚糖酶的編碼基因在進行替換后得到了有效的表達和分泌，菌株SC—βG1、SC—βG2培養(yǎng)過程中最高酶活性出現(xiàn)在培養(yǎng)56—64h時，分別為28.1U和20.2U，與用表達載體表達時的出現(xiàn)最高酶活性的時間基本一致。重組菌對數(shù)期的生長速度與出發(fā)菌株相比略慢，但

7、穩(wěn)定期的細胞濃度基本一致。而且穩(wěn)定期以后的生長變化趨勢基本一致。
　　 考慮到菌株應用的安全性，利用Cre/loxP系統(tǒng)成功的刪除了在構建產(chǎn)β—1，3—1，4—葡聚糖酶的酵母菌株SC—βG1時整合在染色體上的KanMX，而且利用實驗中使用的包含Cre/loxP系統(tǒng)的質粒pSH—Z的不穩(wěn)定性，通過傳代使質粒丟失而篩選到2株無抗性標記的重組酵母菌株SC—βG1A、SC—βG1B，整合到重組菌株基因組中的bglS基因表達單元沒受到影響

8、。對最終獲得的無抗性標記的菌株SC—βG1A、SC—βG1B分泌的β—1，3—1，4—葡聚糖酶酶活進行了測定，結果顯示刪除Kanr的菌株保留了原來菌株的β—1，3—1，4—葡聚糖酶活性，分別為32.3U和29.1U。
　　 對最終獲得的重組菌株在實驗室進行了繼代培養(yǎng)并對其遺傳穩(wěn)定性、生長性能、發(fā)酵力、凝聚性、熱死滅溫度等幾個重要的生理指標進行了測試，并對發(fā)酵液進行了蛋白酶A活性，β—葡聚糖酶活性的測定和研究。結果表明重組菌株在麥

9、芽汁發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生較高活性的β—葡聚糖酶。被替換掉一個等位PEP4基因的釀酒酵母菌株的蛋白酶A的活性與出發(fā)菌株WZ65相比降低了30—40％。重組菌SC—βG1A、SC—βG1B中bglS表達單元在傳代過程中遺傳穩(wěn)定，不發(fā)生丟失。與對照菌株相比，重組菌初期生長變緩，但穩(wěn)定期細胞濃度基本相同，穩(wěn)定期以后的濃度變化一致；熱死滅溫度降低2℃；轉化菌遺傳性能穩(wěn)定，與對照菌生長性能、發(fā)酵力、凝聚性均基本相似。
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