同源重組技術(shù)構(gòu)建蛋白酶A低表達(dá)且能產(chǎn)β-葡聚糖酶的釀酒酵母菌株及其性能研究.pdf

1、β—葡聚糖在啤酒生產(chǎn)中會造成過濾困難以及成品啤酒的非生物性混濁等問題，一定程度上影響啤酒的質(zhì)量和保質(zhì)期。啤酒泡沫，特別是純生啤酒的泡沫問題會受到蛋白酶A(PrA)很大程度的影響。現(xiàn)代啤酒工業(yè)中通過生產(chǎn)過程中添加微生物來源的β—葡聚糖酶制劑以及PrA的抑制劑等手段來降低它們帶來的消極影響，但這無疑使啤酒生產(chǎn)變得復(fù)雜而且提高了成本。因此，本研究采用同源重組技術(shù)以枯草芽孢桿菌的β—葡聚糖酶基因替換釀酒酵母染色體組中的一個(gè)PEP4等位基因，構(gòu)建

2、能夠降解β—葡聚糖而PrA低表達(dá)的重組釀酒酵母。結(jié)果表明，構(gòu)建的重組菌株能有效的分泌β—葡聚糖酶同時(shí)降低了PrA的表達(dá)，在刪除了進(jìn)行基因操作時(shí)引入的抗性標(biāo)記基因后，構(gòu)建完成了適合于啤酒工業(yè)特別是純生啤酒釀造的重組釀酒酵母菌株。同時(shí)對重組釀灑酵母菌株的生理和發(fā)酵性能進(jìn)行了研究。主要研究結(jié)果如下：
　　 從釀酒酵母基因組中PCR擴(kuò)增PGK1啟動(dòng)子、MFα1信號肽以及ADH1終止子序列，構(gòu)建了在釀酒酵母的啟動(dòng)子、分泌序列、終止子作用下

3、的枯草芽孢桿菌bglS基困(編碼β—1，3—1，4—葡聚糖酶)在釀酒酵母中的表達(dá)單元。并以KanMX自kanr為篩選標(biāo)記，以質(zhì)粒Yeplac181為出發(fā)質(zhì)粒構(gòu)建了釀酒酵母的表達(dá)載體。表達(dá)載體中包含的bglS表達(dá)單元轉(zhuǎn)入工業(yè)釀酒酵母菌株WZ65得到了表達(dá)，并得到了有效分泌。用DNS法對重組酵母菌生長過程中分泌到培養(yǎng)介質(zhì)中的β—葡聚糖酶活性進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示在60h出現(xiàn)最大值，然后下降，在接下來的60h內(nèi)基本保持穩(wěn)定。
　　 在前

4、人研究的基礎(chǔ)上對β—葡聚糖酶活性測定方法進(jìn)行改進(jìn)，用剛果紅法可以更好的對本文構(gòu)建的重組釀酒酵母菌株分泌的β—葡聚糖酶酶活進(jìn)行測定。對重紐酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，并與枯草芽孢桿菌中表達(dá)的野生型β—葡聚糖酶的性質(zhì)進(jìn)行了對比。研究發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)構(gòu)建的重組酵母表達(dá)的重組β—葡聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)發(fā)生了改變。40℃熱處理20min造成重組酶活很大損失，殘留的酶活只有30℃處理的63.4％；70℃的熱處理與40℃處理相比酶活性只降低了17.5％，保持了45

5、.9％的最初酶活，重組酶在高溫下的穩(wěn)定性增強(qiáng)。與野生酶相比，重組酶的最適pH值為5.0，而野生酶在6.0—7.0之間；相比野生酶在pH6.0—7.0有較高的穩(wěn)定性，重組酶在pH5.0—6.0之間有最大的穩(wěn)定性。
　　 由于釀酒酵母中表達(dá)載體不穩(wěn)定，為了使β—葡聚糖酶在重組酵母菌株更穩(wěn)定的表達(dá)而且降低蛋白酶A對啤灑泡沫陽性蛋白的降解作用，在前期試驗(yàn)證明了構(gòu)建的bglS表達(dá)單元正確的基礎(chǔ)上，用bglS基因表達(dá)單元替換了出發(fā)酵母菌株W

6、Z65染色體上的一個(gè)PEP4等位基因，構(gòu)建了PEP4等位基因雜合的重組釀酒酵母菌株SC—βG1、SC—βG2，其基因型為：PEP4/pep4：：KanMX—bglS。β—1，3—1，4—葡聚糖酶的編碼基因在進(jìn)行替換后得到了有效的表達(dá)和分泌，菌株SC—βG1、SC—βG2培養(yǎng)過程中最高酶活性出現(xiàn)在培養(yǎng)56—64h時(shí)，分別為28.1U和20.2U，與用表達(dá)載體表達(dá)時(shí)的出現(xiàn)最高酶活性的時(shí)間基本一致。重組菌對數(shù)期的生長速度與出發(fā)菌株相比略慢，但

7、穩(wěn)定期的細(xì)胞濃度基本一致。而且穩(wěn)定期以后的生長變化趨勢基本一致。
　　 考慮到菌株應(yīng)用的安全性，利用Cre/loxP系統(tǒng)成功的刪除了在構(gòu)建產(chǎn)β—1，3—1，4—葡聚糖酶的酵母菌株SC—βG1時(shí)整合在染色體上的KanMX，而且利用實(shí)驗(yàn)中使用的包含Cre/loxP系統(tǒng)的質(zhì)粒pSH—Z的不穩(wěn)定性，通過傳代使質(zhì)粒丟失而篩選到2株無抗性標(biāo)記的重組酵母菌株SC—βG1A、SC—βG1B，整合到重組菌株基因組中的bglS基因表達(dá)單元沒受到影響

8、。對最終獲得的無抗性標(biāo)記的菌株SC—βG1A、SC—βG1B分泌的β—1，3—1，4—葡聚糖酶酶活進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示刪除Kanr的菌株保留了原來菌株的β—1，3—1，4—葡聚糖酶活性，分別為32.3U和29.1U。
　　 對最終獲得的重組菌株在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了繼代培養(yǎng)并對其遺傳穩(wěn)定性、生長性能、發(fā)酵力、凝聚性、熱死滅溫度等幾個(gè)重要的生理指標(biāo)進(jìn)行了測試，并對發(fā)酵液進(jìn)行了蛋白酶A活性，β—葡聚糖酶活性的測定和研究。結(jié)果表明重組菌株在麥

9、芽汁發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生較高活性的β—葡聚糖酶。被替換掉一個(gè)等位PEP4基因的釀酒酵母菌株的蛋白酶A的活性與出發(fā)菌株WZ65相比降低了30—40％。重組菌SC—βG1A、SC—βG1B中bglS表達(dá)單元在傳代過程中遺傳穩(wěn)定，不發(fā)生丟失。與對照菌株相比，重組菌初期生長變緩，但穩(wěn)定期細(xì)胞濃度基本相同，穩(wěn)定期以后的濃度變化一致；熱死滅溫度降低2℃；轉(zhuǎn)化菌遺傳性能穩(wěn)定，與對照菌生長性能、發(fā)酵力、凝聚性均基本相似。
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