低氧調(diào)控細(xì)胞因子分泌及糖代謝的作用與機(jī)制.pdf

1、低氧是任何一種生理性氧量不足或組織需氧量不足的狀態(tài)。由于大氣壓的降低引起的缺氧稱為低壓性低氧（hypobaric hypoxia），高原低氧屬于低壓性低氧。而多種疾病如心肺功能衰竭、腫瘤等病理生理過程也與低氧密切相關(guān)[1]。機(jī)體對低氧的反應(yīng)和適應(yīng)是一個多層次和機(jī)制復(fù)雜的調(diào)控過程。在組織器官水平表現(xiàn)在造血系統(tǒng)的激活或紅細(xì)胞增加，以及呼吸系統(tǒng)功能改變等。而久居高原的人們在長期進(jìn)化過程中機(jī)體形成了一系列適應(yīng)低氧環(huán)境的生理機(jī)制。細(xì)胞水平的改變包

2、括細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、特征以及生物學(xué)特性生長改變。細(xì)胞生長因子分泌和細(xì)胞代謝改變是多種細(xì)胞低氧反應(yīng)的共同特征，受基因組、轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳改變等多層次環(huán)節(jié)的調(diào)控。
　　不同細(xì)胞類型對低氧反應(yīng)的程度和特點(diǎn)不同。造血系統(tǒng)是由造血微環(huán)境和造血細(xì)胞組成，是對低氧反應(yīng)最敏感的系統(tǒng)之一。骨髓微環(huán)境分泌多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)造血細(xì)胞的粘附、遷移，歸巢和增殖分化。一般認(rèn)為造血微環(huán)境保持一種低氧狀態(tài)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是骨髓微環(huán)境的重要細(xì)胞組成部分，也是研究細(xì)胞低氧

3、反應(yīng)的理想模型。
　　細(xì)胞對低氧適應(yīng)的調(diào)節(jié)中，特異性 miRNAs可調(diào)控大量編碼蛋白基因的表達(dá)并發(fā)揮重要調(diào)控作用。多種重要的miRNAs通過調(diào)控HIFs參與低氧適應(yīng)的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致血管生長因子的表達(dá)變化從而影響細(xì)胞的生物學(xué)特性。miR-17-92基因簇含有的6個miRNA,包括miR-17、miR-18、MiR-19a、miR-19b、miR20和miR-92的基因腫瘤miRNA簇。它在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中，可通過調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的增殖

4、和遷移發(fā)揮促血管新生的作用。但其是否參與低氧調(diào)控及機(jī)制并不清楚。細(xì)胞線粒體是受低氧影響最敏感的細(xì)胞器之一。Ptpmt1是位于細(xì)胞線粒體上的線粒體蛋白酪氨酸磷酸酶家族的成員，參與能量代謝，被證明與心磷脂合成有關(guān)?？紤]到Ptpmt1在細(xì)胞中能量代謝和磷脂類物質(zhì)代謝中的重要性，闡明它與低氧的關(guān)系及其它信號的關(guān)聯(lián)性將具有重要意義。SPK是合成 S1P并維持細(xì)胞內(nèi)脂類代謝產(chǎn)物平衡的重要限速酶，也是細(xì)胞代謝的重要細(xì)胞信號分子。SPK低氧調(diào)節(jié)并參與促

5、血管新生。低氧能夠激活多條細(xì)胞存活相關(guān)的信號通路，如PI3/AKT、Sirt1、MAPK等，而SPK和這些信號通路存在很廣泛的關(guān)聯(lián)性。SPK又是一個低氧誘導(dǎo)的反應(yīng)分子，其介導(dǎo) SPK/S1P信號通路無疑在低氧導(dǎo)致的異常能量代謝過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。闡明其和SPK調(diào)控Ptpmt1的信號對糖代謝作用的影響及協(xié)同作用，將更深入闡釋細(xì)胞低氧反應(yīng)的機(jī)制。
　　本課題利用間充質(zhì)干細(xì)胞和紅系白血病細(xì)胞系TF-1為模型，從miRNA和細(xì)胞信號

6、水平，研究了低氧調(diào)控細(xì)胞因子分泌及糖代謝的作用與機(jī)制。闡明了miR-17-92在低氧誘導(dǎo)BM-MSCs細(xì)胞因子分泌的作用；證明了線粒體酪氨酸磷酸化酶1（Ptpmt1）是一個低氧誘導(dǎo)的線粒體能量代謝相關(guān)分子；并證明了磷酸鞘氨醇信號和Ptpmt1參與細(xì)胞增殖、存活及能量代謝的調(diào)節(jié)。
　　一、miRNA17-92調(diào)控低氧誘導(dǎo)BM-MSCs分泌血管生長因子
　　BM-MSCs能夠分泌的各種細(xì)胞因子，包括HGF、VEGF和ANG-1等

7、。已知低氧預(yù)處理能夠提高BM-MSCs分泌血管生長因子的能力，并提高BM-MSCs治療缺血性疾病的效果。但是，低氧誘導(dǎo)血管生長因子分泌的作用和機(jī)制還不清楚。特異性的microRNA是低氧誘導(dǎo)細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)的重要的調(diào)控環(huán)節(jié)。miRNA-17-92是與腫瘤發(fā)生和血管新生密切相關(guān)的microRNA簇。我們利用PCR、ELISA和基因轉(zhuǎn)移等方法闡明了miR-17在BM-MSCs分泌血管生長因子中調(diào)控作用與機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)利用貼壁培養(yǎng)方法，

8、培養(yǎng)、鑒定并擴(kuò)增了 BM-MSCs。BM-MSCs具有成脂和成骨分化的能力，表達(dá)CD73、CD90、CD105等間質(zhì)分子，不表達(dá)CD11b、CD34、CD45等造血細(xì)胞的表面抗原。BM-MSC具有向成脂和成軟骨分化的能力。低氧1％ O2處理能夠誘導(dǎo)BM-MSCs表達(dá)VEGF、HGF和ANG-1等血管生長因子，同時Hif-1α的表達(dá)水平也明顯提高。與此同時，miR-17-92的表達(dá)檢測結(jié)果表明，miR-17和 miR-18經(jīng)低氧刺激后的表

9、達(dá)水平明顯降低。轉(zhuǎn)染miR-17的抑制劑能夠促進(jìn)BM-MSCs分泌上述的血管生長因子，提示miR-17表達(dá)減低參與BM-MSCs分泌血管生長因子調(diào)控。慢病毒介導(dǎo)miR-17-92高表達(dá)能夠增強(qiáng)BM-MSCs的增殖能力，但低氧狀態(tài)下，其促增殖能力明顯低于常氧狀態(tài)。我們研究結(jié)果提示miR-17是低氧誘導(dǎo)血管生長因子分泌的負(fù)調(diào)控分子。
　　Hif-1α是介導(dǎo)低氧誘導(dǎo)細(xì)胞促血管活性物質(zhì)分泌的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。利用生物信息學(xué)分析表明Hif-

10、1α3′-UTR存在miR-17的結(jié)合序列。我們構(gòu)建了miR-17的結(jié)合序列Hif-1α3′-UTR報告基因載體，利用熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)證明了Hif-1α是miR-17的靶基因。miR-17模擬物轉(zhuǎn)染BM-MSCs可抑制其Hif-1α的表達(dá)。從而證明了低氧下調(diào)miR-17表達(dá)，導(dǎo)致靶基因Hif-1α上調(diào)促進(jìn)血管生長因子分泌的新機(jī)制。
　　二、SPK及Ptpmt1參與低氧導(dǎo)致糖代謝變化
　　低氧可引起人類和動物的細(xì)胞代謝失衡，包

11、括線粒體功能障礙與氧化應(yīng)激。然而，缺氧導(dǎo)致線粒體功能障礙和能量代謝失衡的機(jī)制仍不清楚。細(xì)胞膜磷脂代謝衍生物神經(jīng)酰胺(ceramide,Cer)、鞘氨醇(sphingosine,Sp)及1-磷酸鞘氨醇(sphingosine1-phospate,S1P)在調(diào)控細(xì)胞增殖、存活及能量代謝過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，其中S1P也是重要的促血管生成信號分子。鞘氨醇激酶（SPK）是細(xì)胞內(nèi)合成S1P并調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Cer、SP、S1P代謝平衡的一種關(guān)鍵酶。線

12、粒體酪氨酸磷酸化酶1（Ptpmt1）是線粒體特異的酪氨酸磷酸酶。我們利用人紅白血病細(xì)胞系（TF-1）研究了SPK信號通路及Ptpmt1在低氧所致糖代謝紊亂中的作用，并探討了SPK信號和Ptpmt1的關(guān)聯(lián)性。
　　低氧培養(yǎng)或化學(xué)模擬低氧試劑（DFO）處理TF-1細(xì)胞都能夠誘導(dǎo)Hif-1α、Hif-2α、SPK和Ptpmt1的上調(diào)。證明了SPK及Ptpmt1都是低氧誘導(dǎo)表達(dá)的分子。利用慢病毒介導(dǎo)Hif-1αshRNA、Hif-2α s

13、hRNA轉(zhuǎn)染，建立了HIF-1α和HIF-2α沉默TF-1細(xì)胞系。確定了只有沉默Hif-2α shRNA才能降低Ptpmt1的表達(dá)，表明Ptpmt1是Hif-2α的下游分子。為闡明SPK信號和Ptpmt1在低氧誘導(dǎo)促進(jìn)生成血管生長因子和能量代謝中的作用。我們構(gòu)建了攜帶 SPK-shRNA、Ptpmt1-shRNA慢病毒載體并制備了慢病毒，感染TF-1細(xì)胞后能夠有效干涉SPK和Ptpmt1的表達(dá)。利用RT-PCR和蛋白印跡技術(shù)證實(shí)了干涉效

14、率。通過CCK-8測定細(xì)胞增殖活力，通過流式細(xì)胞儀檢測 AnnexinV和 PI雙標(biāo)記確定細(xì)胞凋亡情況。發(fā)現(xiàn)SPK-shRNA和Ptpmt1-shRNA轉(zhuǎn)染能夠明顯抑制細(xì)胞的增殖并且誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。研究結(jié)果表明SPK和Ptpmt1是維持細(xì)胞增殖和存活的重要磷酸酶。我們進(jìn)一步觀察了敲低SPK和Ptpmt1表達(dá)的TF-1細(xì)胞的葡萄糖代謝的情況。SPK和Ptpmt1敲低能夠明顯減低細(xì)胞葡萄糖的利用和消耗。糖轉(zhuǎn)運(yùn)分子是細(xì)胞糖代謝的協(xié)同分子，我們

15、利用RT-qPCR的方法發(fā)現(xiàn)Ptpmt1受抑制可以減少Glut1和 Glut3的表達(dá)，從而降低TF-1細(xì)胞葡萄糖的消耗。更有意義的是，通過JC1染色確定了Ptpmt1基因敲低可導(dǎo)致線粒體功能障礙。為確定SPK信號和Ptpmt1之間的相關(guān)性，我們利用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)shRNA或SPK抑制劑DMS抑制TF-1細(xì)胞SPK活性。SPK抑制能夠提高Ptpmt1的表達(dá)，表明這兩個信號分子在細(xì)胞內(nèi)存在相互作用和競爭性抑制關(guān)系。我們研究結(jié)果說明低氧上調(diào) SP