高糖對(duì)腎臟細(xì)胞因子分泌的影響及纈沙坦的干預(yù)作用研究.pdf

1、研究背景：糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末期腎?。╡nd stage renal disease,ESRD）的主要原因，主要以系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白和腎小管基底膜的過度積累引起的腎小球系膜增生、蛋白尿以及進(jìn)行性腎功能不全為特點(diǎn)，并最終進(jìn)展成為腎小球硬化及腎小管間質(zhì)纖維化。高血糖對(duì)腎臟細(xì)胞有明顯的損傷作用。在不同腎

2、臟細(xì)胞中，高糖可激活多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，刺激細(xì)胞因子的產(chǎn)生。體外和體內(nèi)研究表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)在DN以及腎小球硬化癥的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。Ang II是腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的主要效應(yīng)分子，在高糖所致的腎臟損害中起到重要作用。纈沙坦(Valsartan,Val)作為AT1受體拮抗劑，目前已經(jīng)成為治療DN的一線藥物。本研究通過離體灌流腎臟(is

3、olated perfusedkidney，IPK)模型和體外細(xì)胞培養(yǎng)方法，探索研究高糖和纈沙坦對(duì)TGF-β1、VEGF和PDGF-BB三種細(xì)胞因子表達(dá)的影響及其表達(dá)的先后順序，為DN的發(fā)生機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：本實(shí)驗(yàn)采用離體灌流腎臟和系膜細(xì)胞兩種模型，分別觀察高糖(30.0mmol/L)和纈沙坦(lO-6mol/L)在0.5h,lh，2h，4h和6h時(shí)對(duì)TGF-β1、VEGF和PDGF-BB三種細(xì)胞因子表達(dá)的影響

4、。
　　 第一部分高糖對(duì)離體大鼠腎臟灌流時(shí)細(xì)胞因子的影響及纈沙坦的干預(yù)作用
　　 將離體腎臟置于37℃恒溫浴槽里持續(xù)灌流，灌流液分為對(duì)照組(葡萄糖lO.Ommo/L)，高糖組（葡萄糖30.Ommol/L）和纈沙坦組(葡萄糖30.0rnmol/L+纈沙坦10-6mol/L)。灌流壓80mmHg，灌流量10ml/min，搜集灌流開始后0.5h，1h,2h,4h和6h時(shí)的尿液并記錄尿量。
　　 1.高糖對(duì)大鼠IPK腎功

5、能的影響及纈沙坦的干預(yù)作用
　　 灌流結(jié)束后，取腎組織進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，HE染色，觀察腎臟組織形態(tài)。采用試劑盒測(cè)定尿液樣本中的肌苷、LDH以及鉀離子濃度指標(biāo)。
　　 2.高糖對(duì)大鼠IPK細(xì)胞因子的影響及纈沙坦的干預(yù)作用：腎組織切片采用免疫組織化學(xué)染色法觀察高糖和纈沙坦對(duì)TGF-β1、VEGF和PDGF-BB三種細(xì)胞因子表達(dá)的影響。
　　 第二部分高糖對(duì)大鼠系膜細(xì)胞細(xì)胞因子的影響及纈沙坦的干預(yù)作用
　　 取

6、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期系膜細(xì)胞，消化后按lxl04/ml/孔接種于24孔板，將滅菌的蓋玻片放入培養(yǎng)板的孔內(nèi)，賴氨酸包被后，使細(xì)胞爬片。常規(guī)培養(yǎng)24h后，換無血清培養(yǎng)24h，使細(xì)胞同步于Go期，分為：對(duì)照組(葡萄糖10.0mml/L)，高糖組(葡萄糖30.0mmol/L)和纈沙坦組(葡萄糖30.0mmol/L+纈沙坦10-6mo/L)。分別于培養(yǎng)0.5h，lh，2h，4h和6h后，采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法觀察高糖和纈沙坦對(duì)體外培養(yǎng)的系膜細(xì)胞中TGF-β

7、1、VEGF和PDGF-BB三種細(xì)胞因子的表達(dá)。采用ELISA法觀察高糖和纈沙坦對(duì)體外培養(yǎng)的系膜細(xì)胞中TCF-β1的含量。
　　 采用RT-PCR法觀察高糖和纈沙坦對(duì)體外培養(yǎng)的系膜細(xì)胞中TGF-β1、VEGF和PDGF-BB三種細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 第一部分高糖對(duì)離體大鼠腎臟灌流時(shí)細(xì)胞因子的影響及纈沙坦的干預(yù)作用
　　 1.高糖對(duì)大鼠IPK腎功能的影響及纈沙坦的干預(yù)作用

8、r>　　 1.1腎組織形態(tài)學(xué)觀察：高糖組中，腎組織形態(tài)受損情況較對(duì)照組嚴(yán)重，隨著灌流時(shí)間的延長(zhǎng)，受損情況加重；纈沙坦組中，腎組織受損情況較高糖組有所改善。
　　 1.2腎功能檢測(cè)指標(biāo)測(cè)定：對(duì)照組中，隨著灌流時(shí)間的延長(zhǎng)，尿量、尿液中肌苷、LDH以及鉀離子濃度值均有所降低；高糖組中，與對(duì)照組比較，尿量、尿液中肌苷、LDH以及鉀離子濃度值降低的趨勢(shì)更為明顯；纈沙坦組中，與高糖組比較，尿量、尿液中肌苷、LDH以及鉀離子濃度值降低的情況

9、得到明顯改善。
　　 2.高糖對(duì)大鼠IPK細(xì)胞因子的影響及纈沙坦的干預(yù)作用
　　 2.1對(duì)大鼠IPK中TGF-β1蛋白表達(dá)的影響：免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，高糖可刺激大鼠IPK中TGF-p1蛋白的表達(dá)，在灌流4h時(shí)TGF-β1蛋白的表達(dá)水平有所下降，在灌流6h時(shí)，TGF-β1蛋白的表達(dá)量有所回升；纈沙坦進(jìn)行干預(yù)后，TGF-β1蛋白的表達(dá)水平受到抑制。
　　 2.2對(duì)大鼠IPK中VEGF蛋白表達(dá)的影響：免疫組織化學(xué)結(jié)果

10、顯示，高糖可刺激大鼠IPK中VEGF蛋白的表達(dá)，在灌流開始2h內(nèi)，VEGF在離體灌流腎臟中的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，灌流2h后，VEGF的表達(dá)量有所下降，略高于對(duì)照組；纈沙坦進(jìn)行干預(yù)后，VEGF蛋白的表達(dá)水平受到抑制。
　　 2.3對(duì)大鼠IPK中PDGF-BB蛋白表達(dá)的影響：免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，對(duì)照組中，PDGF-BB在離體灌流腎臟中的表達(dá)水平逐漸下降；高糖組中，PDGF-BB的表達(dá)水平逐漸下降，但高于對(duì)照組，在灌流6h時(shí)，表達(dá)

11、水平有所回升；纈沙坦進(jìn)行干預(yù)后，PDGF-BB蛋白的表達(dá)水平明顯低于高糖組。
　　 第二部分高糖對(duì)大鼠系膜細(xì)胞細(xì)胞因子的影響及纈沙坦的干預(yù)作用
　　 1.高糖對(duì)系膜細(xì)胞細(xì)胞因子蛋白表達(dá)的影響及纈沙坦的干預(yù)作用
　　 1.1對(duì)大鼠系膜細(xì)胞TGF-βl蛋白表達(dá)的影響：免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，正常系膜細(xì)胞中，TGF-β1隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)增強(qiáng)；在系膜細(xì)胞開始培養(yǎng)2h內(nèi)，高糖可促使TGF-D1蛋白表達(dá)增加，培養(yǎng)2h后，

12、TGF-β1的表達(dá)水平有所下降，6h時(shí)，TGF-β1的表達(dá)水平有所有所回升，但與對(duì)照組相差不大；纈沙坦進(jìn)行干預(yù)后，TGF-β1蛋白的表達(dá)水平受到抑制。采用ELISA法檢測(cè)高糖和纈沙坦條件下，體外培養(yǎng)的系膜細(xì)胞細(xì)胞液中TGF-β1的含量，結(jié)果顯示：在高糖刺激下，系膜細(xì)胞分泌TGF-βI較對(duì)照組有所增多，在6h時(shí)系膜細(xì)胞分泌TGF-β1減少，并低于對(duì)照組；加入纈沙坦干預(yù)后，系膜細(xì)胞分泌TGF-β1明顯減少，尤其是在培養(yǎng)2h和4h時(shí)。

13、　　 1.2對(duì)大鼠系膜細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)的影響：免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，正常系膜細(xì)胞中，VEGF隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)增強(qiáng)；在系膜細(xì)胞培養(yǎng)0.5h、lh和2h時(shí)，高糖可促使VEGF的表達(dá)水平逐漸增加，在培養(yǎng)4h和6h時(shí)，VEGF的表達(dá)水平有所下降，但均高于對(duì)照組的表達(dá)水平；纈沙坦進(jìn)行干預(yù)后，VEGF蛋白的表達(dá)水平明顯低于高糖組，并具有顯著性差異。
　　 1.3對(duì)大鼠系膜細(xì)胞PDGF-BB蛋白表達(dá)的影響：免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，在

14、對(duì)照組中，PDGF-BB在大鼠系膜細(xì)胞中有所表達(dá)，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)增強(qiáng)；高糖刺激PDGF-BB在大鼠系膜細(xì)胞中的表達(dá)量增加，其表達(dá)水平略高于對(duì)照組，但無顯著性差異；纈沙坦進(jìn)行干預(yù)后，PDGF-BB蛋白的表達(dá)水平受到抑制。
　　 2.高糖對(duì)系膜細(xì)胞細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響及纈沙坦的干預(yù)作用：RT-PCR結(jié)果顯示，高糖可促進(jìn)TGF-β1、VEGF和PDGF-BBmRNA的表達(dá)，加入纈沙坦后，高糖的刺激作用受到抑制。在培養(yǎng)開

15、始時(shí)，TGF-β1 mRNA表達(dá)水平較高，VEGF和PDGF-BB mRNA表達(dá)水平較低，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，VEGF和PDGF-BB mRNA表達(dá)逐漸加強(qiáng)，而TGF-pI mRNA表達(dá)水平有降低的趨勢(shì)。
　　 結(jié)論：高糖可以引起離體灌流腎臟功能損傷，使尿量減少、肌酐清除率降低、LDH活性下降，纈沙坦可明顯改善高糖所致離體灌流腎臟功能的損傷。高糖可以刺激離體灌流腎臟和體外系膜細(xì)胞培養(yǎng)中TGF-β1、VEGF和PDGF-BB的表