血管緊張素Ⅱ?qū)epG2細(xì)胞葡萄糖代謝的影響及纈沙坦的干預(yù)作用.pdf

1、背景與目的：
　　 高血壓和糖尿病是人類(lèi)的二大殺手,二者關(guān)系密切并與心,腦血管疾病的發(fā)生有關(guān)。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(Angiotensin Converting Enzyme Inhibitor,ACEI)和血管緊張素受體阻斷劑(Angiotensin Receptor Blocker,ARB)廣泛用于高血壓的治療及延緩糖尿病腎病的發(fā)展。多項(xiàng)循證醫(yī)學(xué)研究(HOPE,LIFE,VALLE及NAVIGATOR)均發(fā)現(xiàn)ACEI及ARB可減

2、少新發(fā)2型糖尿病的發(fā)生。但以觀察雷米普利和羅格列酮減低糖尿病前期向糖尿病轉(zhuǎn)換為目的的DREAM研究,未證明雷米普利可顯著減少糖尿病前期發(fā)展為糖尿病。以評(píng)價(jià)長(zhǎng)期服用那格列奈和纈沙坦對(duì)延緩IGT患者進(jìn)展為糖尿病的效果為目的的NAVIGATOR研究揭示纈沙坦(代文)可減少14％的葡萄糖耐量異常(Impaired Glucose Tolerance,IGT)發(fā)展為糖尿病。ACEI及ARB如何減少了新發(fā)糖尿病的發(fā)生及IGT向糖尿病的轉(zhuǎn)化?血管緊張

3、素2(AngiotensinⅡ,AngⅡ)對(duì)糖代謝的影響如何?ARB的代表之一:纈沙坦(代文)可否阻斷其作用?AngⅡ?qū)μ谴x的影響有無(wú)血管緊張素2受體以外的作用是本文的研究目的。
　　 除了多項(xiàng)循證醫(yī)學(xué)觀察到的現(xiàn)象外,AngⅡ,ACEI及ARB對(duì)葡萄糖代謝及胰島素分泌和作用的影響已有一些研究結(jié)果。AngⅡ可影響胰島素的信號(hào)傳導(dǎo),而ACEI和ARB可改善胰島素的信號(hào)傳導(dǎo)。此外,ACEI和ARB可促進(jìn)骨骼肌毛細(xì)血管擴(kuò)張,葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)

4、體4(Glucose Transportcr4,GLUT4)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜,促進(jìn)骨骼肌對(duì)葡萄糖的攝取,近期的研究表明:ACEI或ARB除了減少血中游離脂肪酸水平外,還可增加血中脂聯(lián)素水平。前者可導(dǎo)致胰島素抵抗和肝糖輸出增加,而后者可增加胰島素的敏感性。部分ARB尚有激活PPARγ的活性,PPARγ是噻唑烷二酮的作用靶點(diǎn)。AngⅡ可抑制胰島素的一相分泌,而ACEI和ARB可改善胰島素分泌。肝臟在糖代謝中起著重要的作用,而AngⅡ?qū)Ω闻K糖代謝

5、的影響及ARB可否阻斷其作用研究甚少,因而我們?cè)O(shè)計(jì)了該研究。
　　 本研究采用血管緊張素Ⅱ、纈沙坦與HepG2細(xì)胞株共同培養(yǎng),了解血管緊張素Ⅱ?qū)epG2細(xì)胞糖代謝的影響,并觀察纈沙坦在該過(guò)程中能否發(fā)揮拮抗血管緊張素Ⅱ的作用,并進(jìn)一步明確血管緊張素Ⅱ影響HepG2細(xì)胞糖代謝以及纈沙坦干預(yù)作用的分子機(jī)制,為臨床上同時(shí)預(yù)防和治療高血壓及糖尿病提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.培養(yǎng)HepG2細(xì)胞,提取HepG2細(xì)

6、胞總RNA,進(jìn)行RT-PCR分析,確定HepG2中AngⅡ受體的存在。
　　 2.1 HepG2細(xì)胞分為:對(duì)照組,血管緊張素Ⅱ組(終濃度分別為10-3mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L),并各設(shè)平行組,分別培養(yǎng)48h后,每孔加入20ulMTT(5mg/ml),繼續(xù)培養(yǎng)4h后移去原有培養(yǎng)液,加入150ulDMS0使結(jié)晶物溶解,用搖床震蕩

7、10min,置酶標(biāo)儀,測(cè)定492nm處吸光度(0D值),以0D值反映細(xì)胞活性和數(shù)量的多少。各濃度血管緊張素Ⅱ組0D值與對(duì)照組0D值比值反映細(xì)胞存活率。
　　 2.2 HepG2細(xì)胞分組同上。各組細(xì)胞在不同濃度的AngⅡ下分別作用24h,36h,48h,GOD-POD法測(cè)各組上清葡萄糖的濃度,以不鋪細(xì)胞的空白孔葡萄糖含量均值相減,得出各孔細(xì)胞的葡萄糖消耗量。比較各組間差異,確定對(duì)肝臟糖代謝作用最明顯的AngⅡ的濃度和作用時(shí)間。

8、r>　　 3.HepG2細(xì)胞分為五組:對(duì)照組,血管緊張素Ⅱ組,纈沙坦組(終濃度為10-6mol.L-1),血管緊張素Ⅱ+胰島素組(胰島素終濃度為10-9mol.L-1),血管緊張素Ⅱ+纈沙坦組,血管緊張素Ⅱ+纈沙坦+胰島素組,在第一步實(shí)驗(yàn)確定的對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗影響最明顯的AngⅡ的濃度和作用時(shí)間的基礎(chǔ)上,纈沙坦在加AngⅡ前2h加入細(xì)胞中,共同作用上述己確定的最佳時(shí)間,觀察該條件下對(duì)HepG2細(xì)胞糖代謝糖原合成、糖異生及糖酵

9、解各途徑的干預(yù)作用。各項(xiàng)觀察指標(biāo)的測(cè)定:(糖原的合成:糖原含量/蛋白含量(umol·mg-1),糖異生:葡萄糖生成量/蛋白含量(umol·mg-1),糖酵解:乳酸生成量/蛋白量(mmol·mg-1)和丙酮酸激酶活力/蛋白量(mU·mg-1))。
　　 結(jié)果：
　　 1.AT1R在HepG2細(xì)胞上的表達(dá),初步得到證實(shí)。
　　 2.1.AngⅡ組與對(duì)照組及各濃度組間HepG2細(xì)胞增殖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,實(shí)驗(yàn)所用濃度范圍

10、內(nèi)的AngⅡ?qū)epG2細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響。
　　 2.2 AngⅡ(10-5mol/l)36h時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量明顯減少。不同濃度的AngⅡ?qū)epG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響不同,高濃度AngⅡ較低濃度HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量增加。
　　 3.給予AngⅡ(10-5mol/l)后,AngⅡ組較對(duì)照組HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量明顯減少,糖原的含量明顯下降,HepG2細(xì)胞糖異生量明顯增加,乳酸的生成量明顯下降

11、,丙酮酸激酶活力雖有下降,但是下降差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 給予纈沙坦后:①葡萄糖消耗:AngⅡ+纈沙坦組較AngⅡ組細(xì)胞葡萄糖消耗顯著增加,AngⅡ+纈沙坦+胰島素組較AngⅡ+胰島素組和AngⅡ+纈沙坦組細(xì)胞葡萄糖消耗增加,但差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②糖原合成:AngⅡ+纈沙坦組較AngⅡ組HepG2細(xì)胞糖原合成增加,AngⅡ+纈沙坦+胰島素組較AngⅡ+纈沙坦組細(xì)胞糖原合成進(jìn)一步增加,但較AngⅡ+胰島素組糖原合成的量差異無(wú)

12、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。③糖異生量:AngⅡ+纈沙坦組較AngⅡ組HepG2細(xì)胞細(xì)胞糖異生生成量明顯下降,AngⅡ+纈沙坦+胰島素組較AngⅡ+胰島素組細(xì)胞糖異生量進(jìn)一步下降,但較AngⅡ+纈沙坦組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。④糖酵解:AngⅡ+纈沙坦組較AngⅡ組細(xì)胞乳酸生成量及丙酮酸激酶活力較AngⅡ組有所增加,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,AngⅡ+纈沙坦+胰島素組較AngⅡ組和AngⅡ+纈沙坦組HepG2細(xì)胞乳酸生成量及丙酮酸激酶活力均明顯升高但較AngⅡ+胰

13、島素組乳酸生成量增加,丙酮酸激酶活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.HepG2細(xì)胞可以擴(kuò)增出AT1R條帶,AT1R在HepG2細(xì)胞上的表達(dá)初步得到證實(shí)。
　　 2.不同濃度AngⅡ?qū)epG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響不同,AngⅡ(10-6mol/l)36h時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量明顯減少。高濃度AngⅡ可促進(jìn)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量。
　　 3.AngⅡ?qū)epG2細(xì)胞葡萄糖消耗的影響