聯(lián)合表達成熟胰島素與葡萄糖激酶的HepG2細胞構建研究.pdf

1、研究目的： 糖尿病以胰島素絕對或相對缺乏而引致各種代謝紊亂為主要特征，其病因尚未完全闡明。傳統(tǒng)治療手段為外源性胰島素替代治療，由于與胰島素分泌的生理模式不符，易致血糖波動和劑量不當而引起的相關并發(fā)癥。細胞移植治療是近年研究的熱點，但由于胰島B細胞分離與儲存技術難度較大、代價昂貴，因此尋找新的移植細胞來源是該方法亟待解決的關鍵難題。本課題運用基因重組及轉基因技術，將HepG2細胞成功改建為具有葡萄糖刺激的胰島素分泌能力(gluco

2、se-stimulatedinsulinsecretion，GSIS)的“胰島代理細胞”(artificialbetacell)，從而為該難題的解決找到一條新的途徑。 本課題應用基因共轉染技術，通過逆轉錄病毒載體將GK基因與mhPINS基因共轉染HepG；細胞，并獲得穩(wěn)定表達。該細胞系一方面可表達與分泌成熟胰島素，另一方面通過GK使該細胞的胰島素分泌在一定程度上受葡萄糖濃度調控，故有望成為糖尿病細胞移植治療中較理想的移植細胞來

3、源。 第一部分mhPINS基因逆轉錄病毒轉導體系的建立及在 HepG2細胞中的表達 目的：建立mhPINS基因逆轉錄病毒轉導體系，于HepG2細胞中表達，并進行葡萄糖刺激的胰島素分泌檢測，從而驗證人胰島素原基因定點突變與修飾的效果，了解HepG2／mhPINS細胞的胰島素分泌是否受葡萄糖濃度調控，掌握逆轉錄病毒載體介導基因表達的規(guī)律，同時獲取高滴度的穩(wěn)定產毒細胞克隆PA317／mhPINS備用。 方法：(

4、1)重組逆轉錄病毒載體pL-mhPINS—SN經(jīng)脂質體Lipofectamine2~~~介導，轉包裝細胞PA317，經(jīng)G418選擇培養(yǎng)基篩選，NIH3T3細胞測定病毒滴度，制備高滴度的穩(wěn)定產毒細胞克隆PA317／mhPINS備用，并分別以PCR、RT-PCR、免疫細胞化學染色對PA317／mhPINS細胞中mhPINS基因的整合、轉錄及表達情況進行檢測；(2)以PA317／mhPINS病毒感染HepG2細胞，經(jīng)G418篩選，所獲抗性細胞

5、克隆命名為HepG2／mhPINS，分別以PCR、RT-PCR、Western-blot、RIA對該細胞及培養(yǎng)上清中mhPINS基因的整合、轉錄及表達情況進行檢測；(3)對HepG2／mhPINS細胞進行葡萄糖刺激的胰島素分泌檢測；(4)HepG2／mhPINS細胞培養(yǎng)2月后，以FCM對mhPINS基因的穩(wěn)定表達情況進行檢測。 結果：(1)所獲PA317／mhPINS產毒細胞克隆，其病毒滴度可達10'CFU／mL；PA317／m

6、hPINS細胞的PCR與RT-PCR均獲得286bp的目的條帶，免疫細胞化學染色顯示PA317／mhPINS細胞胞漿內有棕黃色胰島素顆粒，而PA317／pLXSN細胞的上述各項檢測結果均為陰性，證實在PA317／mhPINS細胞中已有mhPINS基因的整合、轉錄及表達。(2)所獲HepG2／mhPINS細胞克隆生長良好，PCR與RT-PCR均獲得286bp的目的條帶；Western-blot檢測可見34kDa的特異性條帶；RIA在其培養(yǎng)

7、上清中檢測到胰島素與C肽；而HepG2/pLXSN細胞的上述各項檢測結果均為陰性，證實在HepG2／mhPINS細胞中已有mhPINS基因的整合、轉錄、表達以及成熟胰島素的分泌。(3)葡萄糖刺激的胰島素分泌檢測顯示，HepG2／mhPINS細胞的胰島素分泌對葡萄糖刺激缺乏反應。(4)HepG2／mhPINS細胞培養(yǎng)2月后，經(jīng)FCM檢測仍有高達67．58％的細胞表達胰島素，證實在HepG2／mhPINS細胞中已獲得mhPINS基因的穩(wěn)定表

8、達。 結論：(1)我們對人胰島素原基因進行的定點突變與修飾是成功的，以mhPINS基因轉染HepG2細胞，可獲得成熟胰島素的分泌；(2)但該細胞的胰島素分泌并不受葡萄糖濃度的調控；(3)通過逆轉錄病毒載體，可獲得目的基因在靶細胞中的長期、穩(wěn)定表達；(4)成功構建了高滴度的穩(wěn)定產毒細胞克隆PA317／mhPINS，為GK基因與mhPINS基因共轉染奠定了基礎。 第二部分GK基因真核表達載體的構建及在COS-7細胞中的表達

9、 目的：構建GK基因真核表達載體pcDNA3．1一GKZl并于COS-7細胞中瞬時表達，驗證所獲質粒pCMV4-GKZl的序列準確性，掌握其在真核細胞中表達的規(guī)律，為GK基因與mhPINS基因共轉染奠定基石出。 方法：(1)獲贈質粒pCMV4-GKZl以EcoRI、BamHI雙酶切，獲得GKZlcDNA，與同樣酶切的pcDNA3．1載體在T4DNA連接酶作用下連接，構建成重組載體pcDNA3．1一GKZl，經(jīng)酶切與測序鑒

10、定。(2)Lipofectamine2~~~介導pcDNA3．1一GKZl轉染COS-7細胞，分別以RT-PCR、Western-blot及免疫細胞化學染色對COS-7／GKZl細胞中GKZl基因的轉錄及表達情況進行檢測。 結果：(1)構建的pcDNA3．1一GKZl重組載體經(jīng)EcoRI、BamHI雙酶切有5．4kb的載體片段及1450bp的GKZlcDNA，GKZlcDNA序列經(jīng)測序證實。(2)COS-7／GKZl細胞RT-P

11、CR擴增出498bp的目的片段；Western-blot可見54kDa的特異性條帶；免疫細胞化學染色顯示COS-7／GKZl細胞胞漿中有GK陽性染色；而COS-7/pcDNA3．1細胞上述各項檢測結果均為陰性，證實在COS一7／GKZl細胞中已獲得GKZl基因的轉錄與瞬時表達。 結論：所獲GKZlcDNA序列準確，可于真核細胞中成功轉錄與表達。 第三部分聯(lián)合表達成熟胰島素與GK的HepG2細胞構建 目的：應用基因

12、共轉染技術構建聯(lián)合表達成熟胰島素與GK的HepG2細胞，并進行葡萄糖刺激的胰島素分泌檢測，驗證該細胞內是否獲得了葡萄糖刺激的胰島素分泌，為進一步的動物體內實驗奠定基礎。 方法：(1)建立GKZl基因逆轉錄病毒轉導體系，制備高滴度的穩(wěn)定產毒細胞克隆PA317／GKZl備用(同第一部分)。(2)運用基因共轉染技術，以GKZl與mhPINS病毒共同感染HepG2細胞，G418挑選抗性細胞克隆，通過Western-blot及RIA檢測抗

13、性細胞中GKZl與mhPINS基因表達，選取聯(lián)合表達成熟胰島素與GK的HepG2細胞克隆，命名為細胞“B”；以RT-PCR對細胞“B”中GKZl與mhPINS基因轉錄進行鑒定，并對細胞“B”行葡萄糖刺激的胰島素分泌反應檢測。 結果：(1)構建的pL-GKZl．SN重組逆轉錄病毒載體經(jīng)酶切鑒定正確；所獲PA317／GKZl產毒細胞克隆，其病毒滴度可達106CFU／mL；PCR、RT-PCR證實PA317／GKZl細胞中已有GKZl

14、基因的整合及轉錄。(2)Western-blot及RIA選取并證實細胞“B”中有兩個目的基因(GKZl、mhPINS)的表達；RT-PCR證實細膨‘B”中有GKZl與mhPINS基因轉錄；葡萄糖刺激的胰島素分泌檢測顯示，細胞“B”具有葡萄糖刺激的胰島素分泌能力，其胰島素分泌開始于葡萄糖濃度為0．75—1．00mmol／L時，最大胰島素分泌出現(xiàn)在葡萄糖濃度為1．75-2．00mmol／L時。 結論：通過逆轉錄病毒載體介導的基因共轉