線粒體融合參與營養(yǎng)缺乏環(huán)境肝癌細(xì)胞糖代謝重編程調(diào)控的作用與機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　線粒體是調(diào)控細(xì)胞代謝最重要的細(xì)胞器，通過不斷地分裂/融合調(diào)控自身功能并對外界刺激做出適應(yīng)性反應(yīng)。大量研究證實(shí)，線粒體分裂/融合異常與多種神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病及代謝性疾病的發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān)。近年來研究證實(shí)，多種類型腫瘤中線粒體分裂/融合發(fā)生異常，并參與腫瘤惡性進(jìn)展。實(shí)體瘤常由于生長過快而導(dǎo)致內(nèi)部出現(xiàn)慢性營養(yǎng)缺乏微環(huán)境，腫瘤細(xì)胞需感知并通過代謝重編程做出適應(yīng)才能繼續(xù)生存，而目前腫瘤適應(yīng)營養(yǎng)缺乏的機(jī)制仍不十分清楚，闡明

2、其機(jī)制對腫瘤防治具有重大意義。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)缺乏環(huán)境時(shí)肝癌細(xì)胞線粒融合變長。作為細(xì)胞能量代謝調(diào)控核心的線粒體，其形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化是否參與肝癌細(xì)胞在營養(yǎng)缺乏時(shí)的代謝適應(yīng)尚不清楚。
　　目的：
　　1.明確營養(yǎng)缺乏環(huán)境對肝癌細(xì)胞線粒體分裂/融合的調(diào)控作用與機(jī)制。
　　2.探討線粒體融合對肝癌細(xì)胞能量代謝的調(diào)控作用。
　　3.分析線粒體融合調(diào)控能量代謝的腫瘤生物學(xué)意義。
　　方法：
　　1.利用Mit

3、o-tracker熒光染色與透射電鏡（TEM）技術(shù)，在肝癌細(xì)胞系與肝癌臨床組織標(biāo)本中分析營養(yǎng)缺乏環(huán)境對線粒體分裂與融合的調(diào)控作用。
　　2.利用qRT-PCR與Western Blot實(shí)驗(yàn)，檢測營養(yǎng)缺乏環(huán)境下參與線粒體分裂/融合調(diào)控的關(guān)鍵分子及其上游信號分子的表達(dá)與活性，分析營養(yǎng)缺乏環(huán)境促進(jìn)線粒體融合的分子機(jī)制。
　　3.利用qRT-PCR、Western Blot與GC-MS（氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用）技術(shù)，分析營養(yǎng)缺乏時(shí)線粒體

4、融合對肝癌細(xì)胞糖酵解與氧化磷酸的調(diào)控。
　　4.利用TEM（透射電鏡）、Blue Native-PAGE、Co-IP、qRT-PCR與Western Blot技術(shù)，對營養(yǎng)缺乏時(shí)線粒體融合調(diào)控氧化磷酸化與糖酵解的機(jī)制進(jìn)行研究。
　　5.利用FCM（流式細(xì)胞術(shù)）與克隆形成實(shí)驗(yàn)，分析營養(yǎng)缺乏時(shí)線粒體融合對肝癌細(xì)胞存活的影響。
　　6.利用裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)，在體內(nèi)分析線粒體融合對腫瘤生長的影響。
　　7.利用IHC實(shí)驗(yàn)，

5、對促進(jìn)營養(yǎng)缺乏環(huán)境下線粒體融合關(guān)鍵分子的表達(dá)進(jìn)行檢測，并對其與肝癌患者臨床參數(shù)及預(yù)后進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　結(jié)果：
　　1.Mito-tracker熒光染色證實(shí)營養(yǎng)缺乏促進(jìn)肝癌細(xì)胞線粒體融合變長；透射電鏡（TEM）對肝癌組織線粒體形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，腫瘤中心區(qū)（營養(yǎng)缺乏）較邊緣區(qū)（營養(yǎng)充足）線粒體變長。
　　2.營養(yǎng)缺乏時(shí)，線粒體分裂/融合調(diào)控關(guān)鍵分子DRP1、FIS1、MFN1、MFN2與OPA1表達(dá)均未發(fā)生顯著變化，而線粒

6、體定位的DRP1因被PKA磷酸化（S637）而減少，導(dǎo)致線粒體變長。
　　3.營養(yǎng)缺乏時(shí)，線粒體融合促進(jìn)肝癌細(xì)胞氧化磷酸而抑制糖酵解。
　　4.營養(yǎng)缺乏時(shí)，線粒體融合通過使線粒體嵴緊密促進(jìn)氧化呼吸鏈復(fù)合體組裝，從而激活氧化磷酸化而抑制糖酵解；線粒體融合通過氧化磷酸化介導(dǎo)的NAD+/SIRT1/HIF-1α信號抑制糖酵解。
　　5.線粒體融合抑制肝癌細(xì)胞在營養(yǎng)缺乏環(huán)境下的凋亡，促進(jìn)肝癌細(xì)胞克隆形成能力。
　　6.營

7、養(yǎng)缺乏誘導(dǎo)的線粒體融合促進(jìn)腫瘤生長。
　　7.介導(dǎo)營養(yǎng)缺乏環(huán)境下線粒體融合的關(guān)鍵分子p-DRP1S937表達(dá)水平與肝癌患者腫瘤分級、TNM分期及血清AFP水平正相關(guān)，與患者預(yù)后顯著負(fù)相關(guān)性。
　　結(jié)論：
　　1.營養(yǎng)缺乏環(huán)境促進(jìn)肝癌細(xì)胞線粒體融合。
　　2.PKA介導(dǎo)的DRP1磷酸化（S637位點(diǎn)）促進(jìn)營養(yǎng)缺乏時(shí)的線粒體融合。
　　3.線粒體融合通過使線粒體嵴形態(tài)重塑調(diào)控肝癌細(xì)胞能量代謝并促進(jìn)肝癌細(xì)胞在營養(yǎng)