利用iPS細(xì)胞技術(shù)開展小鼠肝癌細(xì)胞重編程研究.pdf

1、胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）具有自我更新及多向分化潛能，為發(fā)育學(xué)、遺傳學(xué)、人類疾病的發(fā)病機(jī)理與替代治療等研究提供非常寶貴的資源。自日本和美國(guó)研究小組先后用四種基因?qū)⑿∈?2006年8月)和人(2007年11-12月)的體細(xì)胞在體外重編程為誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(Inducedpluripotentstemcells，iPScells)，在短短5年多時(shí)間內(nèi)，iPS細(xì)胞的研究和關(guān)注度呈爆炸式增長(zhǎng)，并且取得了一些突破性的進(jìn)展。由于iPS細(xì)胞技術(shù)較經(jīng)典的

2、體內(nèi)外重編程方法存在巨大優(yōu)勢(shì)，科學(xué)家們紛紛開始利用此項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行體細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞重編程研究。
　　 iPS細(xì)胞技術(shù)是借助基因?qū)爰夹g(shù)將某些特定因子基因?qū)雱?dòng)物或人的體細(xì)胞，以將其重編程或誘導(dǎo)為ES細(xì)胞樣的細(xì)胞，即iPS細(xì)胞。目前，常用的iPS細(xì)胞技術(shù)包括通過逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒和腺病毒等介導(dǎo)的方式，這些方法均可將轉(zhuǎn)錄因子對(duì)應(yīng)的基因?qū)塍w細(xì)胞，進(jìn)而將其重編程為iPS細(xì)胞。現(xiàn)階段常見的iPS細(xì)胞制備流程包括(1)分離和培養(yǎng)宿主細(xì)胞;(2

3、)通過逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒或腺病毒等介導(dǎo)的方式將外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞;(3)病毒感染后的細(xì)胞消化傳代于飼養(yǎng)層細(xì)胞上，并以ES細(xì)胞專用培養(yǎng)體系來(lái)培養(yǎng)，同時(shí)在培養(yǎng)基中根據(jù)需要加入相應(yīng)的小分子物質(zhì)以促進(jìn)重編程;(4)數(shù)天后，出現(xiàn)ES細(xì)胞樣的克隆。通過上述方法得到的iPS細(xì)胞一般在克隆形態(tài)、生長(zhǎng)特性、表面標(biāo)志物、基因表達(dá)模式、表觀遺傳學(xué)特征、擬胚體形成、畸胎瘤形成和嵌合體形成（針對(duì)動(dòng)物）等方面與ES細(xì)胞的非常相似，因而從以上幾個(gè)方面對(duì)重編程后的細(xì)

4、胞進(jìn)行鑒定。
　　 為了更好地將iPS細(xì)胞技術(shù)與臨床應(yīng)用相結(jié)合，科學(xué)家們經(jīng)過大量研究，獲得了一系列令人欣慰的成果，包括成功將小鼠、大鼠、恒河猴和人等的體細(xì)胞在體外重編程為iPS細(xì)胞，并成功建立了個(gè)體特異的或疾病特異的人iPS細(xì)胞系;開啟了借助轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法高效率將轉(zhuǎn)座子表達(dá)載體導(dǎo)入體細(xì)胞，并將其重編程為virus-freeiPS細(xì)胞;已有科學(xué)家從所獲得的動(dòng)物和人的iPS細(xì)胞中移除先前導(dǎo)入的重編程因子基因，從而獲得近似治療

5、型的iPS細(xì)胞(Virus-free和先前導(dǎo)入的重編程因子基因已被刪除)等等。上述這些成就又進(jìn)一步加大了科學(xué)家們研究iPS細(xì)胞技術(shù)的熱情，關(guān)于iPS細(xì)胞的研究經(jīng)久不衰，并一次次在生命科學(xué)領(lǐng)域引起轟動(dòng)。
　　 而繼成功將鼠和人的體細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞后，科學(xué)家們開始思考將腫瘤細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞的可能性，這一猜想也很快得到了證實(shí)。2008年，Shi-LungLin等將miR302s導(dǎo)入黑色素瘤細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞，成功將腫瘤細(xì)胞

6、重編程為iPS細(xì)胞。2009年7月Hochedlinger課題組用Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四基因?qū)⑿∈蠛谏亓黾?xì)胞重編程為iPS細(xì)胞，2010年，JanE等成功利用Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四因子將慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞。
　　 上述研究成果證實(shí)了從理論上來(lái)說，任何一種（小鼠或人的）體細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞均可被特定的因子重編程為iPS細(xì)胞。也就是說，被逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞不局限于特定的細(xì)胞類型及特

7、定的分化階段，其可以是內(nèi)中外三胚層任一胚層來(lái)源的細(xì)胞，既可以來(lái)源于胚胎細(xì)胞，也可以來(lái)源于新生兒、成人甚至是終末分化的成熟細(xì)胞。而關(guān)于腫瘤細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞的研究，也為在體外研究腫瘤細(xì)胞重編程提供了重要的技術(shù)手段和技術(shù)平臺(tái)，同時(shí)為臨床腫瘤治療開啟了新思路。
　　 研究表明，體細(xì)胞或者腫瘤細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞所需轉(zhuǎn)錄因子組合需根據(jù)細(xì)胞種類及其上相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平或額外加入的小分子加以靈活選擇。一般情況下，Oct4、Sox2、

8、c-Myc和Klf4組合即可將體細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞。適當(dāng)選用小分子化合物加入重編程，可大幅度提高重編程效率和/或減少轉(zhuǎn)錄因子使用個(gè)數(shù)，而當(dāng)增加轉(zhuǎn)錄因子使用個(gè)數(shù)(Oct4、Sox2、Nanog、Lin28、c-Myc和Klf4)，也可大幅度提高重編程效率。
　　 慢病毒基因投遞系統(tǒng)是目前較為常用的基因?qū)爰夹g(shù)，借助慢病毒基因投遞系統(tǒng)可將慢病毒中攜帶的外源基因高效整合進(jìn)宿主基因組中，并且此外源基因可在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)。過去用

9、科學(xué)家們采用分別攜帶Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2四種基因的慢病毒載體進(jìn)行病毒生產(chǎn)，然后將病毒以一定的比例混合感染目的細(xì)胞誘導(dǎo)體細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞重編程。而為了更高效地完成重編程，選擇同時(shí)攜帶Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四種重要基因的載體，可以讓這四種基因更好地發(fā)揮協(xié)同作用，并且長(zhǎng)期保持在一穩(wěn)定水平，更有利于細(xì)胞發(fā)生重編程。報(bào)告基因EGFP的存在，使重編程的過程更為可視化，通過觀察綠色熒光的表達(dá)情況，可以判斷慢病毒將外

10、源基因整合進(jìn)宿主基因組的效率，并且在重編程過程中更加直觀地了解重編程的進(jìn)程，有利于對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。
　　 鑒于此，本試驗(yàn)擬借助慢病毒載體法將同時(shí)攜帶Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四種基因和報(bào)告基因綠色熒光蛋白(EGFP)的載體pLentG-KOSM導(dǎo)入小鼠肝癌細(xì)胞(Hep1-6)，以開展腫瘤細(xì)胞體外重編程研究，在此基礎(chǔ)上構(gòu)筑小鼠腫瘤細(xì)胞體外重編程的技術(shù)平臺(tái)。
　　 方法:
　　 1慢病毒載體pLent

11、G-KOSM的鑒定
　　 酶切鑒定NotⅠ、XbaⅠ線性化pLentG-KOSM，線性化產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳。
　　 PCR鑒定根據(jù)Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2序列設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2基因;PCR擴(kuò)增后，取5μl反應(yīng)液進(jìn)行3％瓊脂糖凝膠電泳。
　　 2慢病毒生產(chǎn)與滴度測(cè)定
　　 慢病毒包裝按標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行慢病毒包裝（脂質(zhì)體介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染）。
　　

12、 慢病毒滴度測(cè)定用5μl病毒上清感染15萬(wàn)293T細(xì)胞，48h后4％多聚甲醛固定，DAPI染色，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)EGFP陽(yáng)性細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)，將其帶入公式:病毒滴度(IU/ml)=EGFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)÷5×1.5×105×103。
　　 3慢病毒載體法重編程Hep1-6細(xì)胞
　　 用病毒感染攜帶有EGFP和KOSM基因的Hep1-6細(xì)胞，12h后棄去病毒感染液，更換為含有10％胎牛的DMEM培養(yǎng)基。
　　

13、將感染后的Hep1-6細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，傳代于飼養(yǎng)層細(xì)胞(feeder)上，更換為新鮮小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)基，之后每天更換培養(yǎng)基直到第10天克隆足夠大時(shí)挑克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。
　　 4重編程后獲得細(xì)胞的生物學(xué)特性
　　 1)重編程后細(xì)胞克隆形態(tài)及EGFP表達(dá)情況;
　　 2)AP染色;
　　 3)RT-PCR檢測(cè)鼠ES細(xì)胞標(biāo)志性基因表達(dá);
　　 4)細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)鼠ES細(xì)胞標(biāo)志性抗原表達(dá);
　　 5

14、)核型分析;
　　 6)懸浮培養(yǎng)觀察擬胚體形成及體外分化情況;
　　 7)重編程后細(xì)胞接種至裸鼠皮下，觀察成瘤情況。
　　 結(jié)果:
　　 1慢病毒載體pLentG-KOSM鑒定
　　 酶切鑒定pLentG-KOSM經(jīng)NotⅠ和XbaⅠ線性化，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳均可見預(yù)期大小的條帶。
　　 PCR鑒定以質(zhì)粒pLentG-KOSM為模板，分別擴(kuò)增Oct4、Klf4、c-Myc和Sox

15、2基因，PCR產(chǎn)物大小均與預(yù)期值相符。
　　 2慢病毒包裝
　　 攜帶pLentG-KOSM的慢病毒載體與病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24h后倒置熒光顯微鏡下可見綠色熒光，預(yù)示轉(zhuǎn)染成功。按照上述方法進(jìn)行慢病毒滴度測(cè)定，病毒滴度值都在1×106IU/ml以上。
　　 3慢病毒載體法重編程Hep1-6細(xì)胞
　　 病毒感染Hep1-6細(xì)胞后48小時(shí)可見綠色熒光，預(yù)示感染Hep1-6細(xì)胞成功，鋪于飼養(yǎng)層細(xì)胞(

16、Feeder)后第4天可見到iPS細(xì)胞樣克隆出現(xiàn)，第10天克隆足夠大可以挑克隆以擴(kuò)大培養(yǎng)，預(yù)示著Hep1-6細(xì)胞已開始重編程。
　　 4.重編程后的細(xì)胞生物學(xué)特性鑒定
　　 1)第2-3天可見Hep1-6細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，4-6天可見iPS細(xì)胞樣克隆，10天左右見到典型iPS細(xì)胞樣克隆，挑取典型克隆繼續(xù)培養(yǎng);多次純化后得到三株典型iPS細(xì)胞樣克隆形態(tài)的細(xì)胞;
　　 2)3株細(xì)胞均具有典型的iPS細(xì)胞樣克隆形態(tài)，A

17、P染色呈陽(yáng)性;
　　 3)3株細(xì)胞未如預(yù)期表達(dá)ES細(xì)胞特有的標(biāo)志性基因Nanog，Esg1，Dax1，Zfp296等;
　　 4)3株細(xì)胞能表達(dá)mES細(xì)胞特有的標(biāo)志性抗原:Oct4(+)，Sox2(+)，Nanog(+);
　　 5)3株細(xì)胞核型分析結(jié)果尚未回報(bào);
　　 6)3株細(xì)胞均具有體外分化形成囊性擬胚體的能力;
　　 7)3株細(xì)胞迄今未能形成畸胎瘤，但是惡性程度較重編程前的Hep1-6細(xì)胞