誘導(dǎo)小鼠ES-iPS細(xì)胞向角膜內(nèi)皮細(xì)胞定向分化的研究.pdf

1、目的：
　　通過(guò)在體外分階段的序貫誘導(dǎo)途徑，探索小鼠胚胎干細(xì)胞(ES)及誘導(dǎo)型多潛能干細(xì)胞(iPS)向角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞定向分化的潛能，探究化學(xué)分子RA，細(xì)胞因子(bFGF、BMP4)聯(lián)合體細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)的具體條件和方案，以期闡明其定向分化中的關(guān)鍵機(jī)制，并驗(yàn)證ES和iPS細(xì)胞作為角膜組織工程種子細(xì)胞的可行性，為組織工程角膜內(nèi)皮層重建尋找來(lái)源充足，安全可靠的新型種子細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.體外撕膜法分離消化新西蘭

2、大白兔的角膜內(nèi)皮細(xì)胞及晶狀體上皮細(xì)胞，建立培養(yǎng)擴(kuò)增體系，并對(duì)其活力和特異性表達(dá)的標(biāo)志物進(jìn)行免疫熒光細(xì)胞化學(xué)（ICC）鑒定。收集晶狀體上皮細(xì)胞的條件培養(yǎng)液，采用MTT法、Ki67的免疫熒光檢測(cè)角膜內(nèi)皮細(xì)胞在條件培養(yǎng)液中的增殖能力，用Western blot評(píng)估其表型標(biāo)記物表達(dá)的變化。
　　2.應(yīng)用mef制備feeder，聯(lián)合ES培養(yǎng)液維持和擴(kuò)增小鼠ES細(xì)胞及iPS細(xì)胞系，并鑒定其全能性指標(biāo)。去除lif因子及feeder，在低黏附培養(yǎng)

3、皿中懸浮培養(yǎng)擬胚體EB，EB形成第四天加入不同濃度RA,并在不同時(shí)間點(diǎn)用定量PCR檢測(cè)神經(jīng)脊分化的指標(biāo)。選擇和比較不同的細(xì)胞外基質(zhì)包括纖維連接蛋白、層粘蛋白、明膠、多聚賴(lài)氨酸和組織液房水作培養(yǎng)板的包被對(duì)神經(jīng)脊（neural crest,NC）細(xì)胞遷出分化的影響，并采用ICC法對(duì)分化標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)。
　　3.用P2-P3的兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞和兔晶狀體上皮細(xì)胞分別進(jìn)行如下共培養(yǎng)處理，包括：①條件培養(yǎng)液收集；②微膠囊包裹隔離共培養(yǎng)；③作為t

4、ranswell小室隔離共培養(yǎng)的細(xì)胞；④絲裂霉素C處理制備飼細(xì)胞鋪層；⑤活性細(xì)胞鋪層。將初步誘導(dǎo)的NC樣細(xì)胞序貫進(jìn)入共培養(yǎng)階段，比較并確定合適的共培養(yǎng)方法。應(yīng)用ICC對(duì)分化后內(nèi)皮樣細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)記關(guān)鍵分子的鑒定，定量PCR對(duì)分化后細(xì)胞mRNA表達(dá)譜的分析。
　　4.采用bFGF+BMP4單層貼壁法誘導(dǎo)ES細(xì)胞向神經(jīng)脊干細(xì)胞分化，后續(xù)條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)向角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞分化，并用ICC鑒定分化標(biāo)記物的表達(dá)情況，用定量PCR分析基因表達(dá)的變

5、化。
　　結(jié)果：
　　1.兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞、晶狀體上皮細(xì)胞在體外可以穩(wěn)定地培養(yǎng)增殖，并表達(dá)其組織特異性的標(biāo)記物。晶狀體的條件培養(yǎng)液對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的增殖沒(méi)有明顯影響，但能上調(diào)角膜內(nèi)皮細(xì)胞中ZO-1，N-cadherin和Vimentin的表達(dá)。
　　2.ES/iPS細(xì)胞在lif和feeder的培養(yǎng)條件下表達(dá)全能性的標(biāo)記物Oct4，SSEA-1，AP(+)；去除lif和feeder后，在懸浮培養(yǎng)過(guò)程中形成擬胚體EB，第四天添

6、加RA繼續(xù)培養(yǎng)，隨后的第四天獲得一組神經(jīng)脊分化標(biāo)記物最高的表達(dá)。EB重新貼壁后繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)有大量細(xì)胞遷出，ICC檢測(cè)顯示有Nestin，P75，AP-2α，SOX10等的表達(dá)。
　　3.Transwell小室，微膠囊包裹的實(shí)驗(yàn)組，EB細(xì)胞遷出生長(zhǎng)，但不能維持良好的長(zhǎng)勢(shì)；在活性細(xì)胞做鋪層的接觸共培養(yǎng)組，EB細(xì)胞遷出受阻，出現(xiàn)大量的細(xì)胞凋亡；在晶狀體上皮細(xì)胞及角膜內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)7-8天后，誘導(dǎo)細(xì)胞形成緊密的鋪路石結(jié)構(gòu)，表達(dá)AQP

7、1，ZO-1，Na+-K+-ATPase，N-cadherin等內(nèi)皮標(biāo)記。在長(zhǎng)時(shí)間明膠鋪層及Fn、Ln、多聚賴(lài)氨酸和兔房水鋪層中，長(zhǎng)時(shí)間明膠鋪層能較好地維持EB貼壁生長(zhǎng)并促進(jìn)向內(nèi)皮樣細(xì)胞的分化。
　　4.在單層細(xì)胞貼壁分化中，bFGF+BMP4誘導(dǎo)ES-cells表達(dá)神經(jīng)脊細(xì)胞的標(biāo)記物，繼續(xù)晶狀體條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)6d出現(xiàn)角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1通過(guò)撕膜法可以建立穩(wěn)定的兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞和晶狀體上皮細(xì)胞

8、的培養(yǎng)體系。晶狀體上皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液能更好地維持角膜內(nèi)皮細(xì)胞的表型包括中ZO-1、N-cadherin、Vimentin，對(duì)細(xì)胞增殖沒(méi)有明顯影響。
　　2.小鼠ES/iPS細(xì)胞可以通過(guò)EB途徑經(jīng)RA誘導(dǎo)向神經(jīng)脊多潛能間充質(zhì)干細(xì)胞分化。在定向分化中，長(zhǎng)時(shí)間的明膠鋪層效果更優(yōu)于Laminin和Fibronectin所做的鋪層。
　　3.條件培養(yǎng)液是一種簡(jiǎn)單、可行、可控的共培養(yǎng)模式。在序貫法誘導(dǎo)方案中，角膜內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液和晶狀