與OP9細胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)人ES細胞向造血分化體系的研究.pdf

1、背景：
　　造血干細胞（HSC）是所有脊椎動物造血細胞形成的中心環(huán)節(jié)，移植后可完全重建造血功能，因此，同種異體造血干細胞移植（allo-HSCT）是治療許多血液疾?。ㄈ绨籽?、地中海貧血、血液腫瘤）的關(guān)鍵。臨床上，成體造血干細胞主要來源于骨髓及臍帶血，而由于來源受限及免疫排斥極大地阻礙了造血干細胞的臨床應(yīng)用。胚胎干細胞(ES)為一類多能干細胞，在體外可無限擴增，且在特定條件下具有向造血干細胞分化的潛能，解決了細胞來源受限、免疫排斥

2、等問題，為人類再生醫(yī)學(xué)和個體化細胞替代療法提供了無限的細胞來源。
　　ES細胞體外誘導(dǎo)造血分化的研究是較為深入的領(lǐng)域之一。其中，OP9細胞是常用的用于誘導(dǎo)造血分化的基質(zhì)細胞系，傳統(tǒng)的共培養(yǎng)誘導(dǎo)周期約為2-3周，耗時長，本實驗選用該誘導(dǎo)方法進行實驗，通過探究最佳OP9細胞的接種密度，以達到縮短誘導(dǎo)分化周期的目的，優(yōu)化體外造血分化體系。通過體外誘導(dǎo)造血分化的技術(shù)，建立人胚胎干細胞體外誘導(dǎo)造血分化的平臺，為干細胞治療奠定基礎(chǔ)，也為研究造

3、血細胞的發(fā)生生育的調(diào)控機制提供了依據(jù)。
　　目的：
　　探索OP9共培養(yǎng)誘導(dǎo)造血分化的最優(yōu)條件，為體外誘導(dǎo)分化及機制研究建立平臺。
　　方法：
　　傳統(tǒng)的與小鼠骨髓間充質(zhì)細胞OP9細胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)造血分化，OP9細胞前期培養(yǎng)以及誘導(dǎo)分化過程的周期約為2-3周，我們利用本實驗室已建系的人胚胎干細胞株HN14，將OP9細胞設(shè)置成實驗組和對照組，實驗組：OP9細胞密度設(shè)置6個梯度即1.5，2.5，3.5，5.0，6.5，

4、8.0×105/ml接種至10cm皿培養(yǎng)24h后，即與HN14共培養(yǎng)誘導(dǎo)造血分化；對照組：應(yīng)用傳統(tǒng)方法，將OP9細胞按1.5×105/ml接種培養(yǎng)4天后，達到融合狀態(tài)后進行共培養(yǎng)。通過觀察形態(tài)變化、流式檢測、實時熒光定量PCR及集落形成實驗比較造血分化的效率。
　　結(jié)果：
　　無論是實驗組還是對照組，鏡下觀察，ES細胞均出現(xiàn)不同程度地分化。采用流式細胞術(shù)檢測共培養(yǎng)過程中第8、10、12天的CD34細胞陽性率，對照組在第12天

5、達高峰，CD34的陽性率達10％左右，相較而言，在實驗組中，CD34的陽性率提前2天達高峰，即在共培養(yǎng)第10天達高峰，且分化效率與對照組無差異（P值＞0.05）。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，中胚層的標(biāo)志性基因BRACHYURY，呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在對照組在第6天達高峰，而實驗組在第4天表達達高峰，這與CD34的表達高峰出現(xiàn)時間相一致。磁珠分選CD34+細胞進行集落形成實驗，證實其具有向各系造血祖細胞分化的能力。本課題組實驗結(jié)果表明

6、，與傳統(tǒng)的OP9細胞需培養(yǎng)4天后進行共培養(yǎng)的方法相比，以5.0-6.5×105/ml密度接種OP9細胞培養(yǎng)僅24h，共培養(yǎng)10天即可達到與對照組相似的分化效率，使誘導(dǎo)分化的周期足足縮短了3-5天，大大提高了分化效率。
　　結(jié)論：
　　1．利用與小鼠OP9基質(zhì)細胞共培養(yǎng)的誘導(dǎo)體系，在本實驗室建立了體外誘導(dǎo)造血分化的平臺，為之后的機制性研究實驗奠定基礎(chǔ)。
　　2．探究最佳OP9細胞接種密度，以5.0-6.5×105/ml接