ANXA3調控小鼠肝癌細胞惡性表型分子機制研究.pdf

1、背景:膜聯(lián)蛋白A3(Annexin A3，ANXA3)是膜聯(lián)蛋白家族成員之一，是Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，有36 kDa和33 kDa兩種亞型，其異常表達與腫瘤發(fā)生發(fā)展、耐藥性和轉移等密切相關。小鼠肝癌Hca-F和Hca-P細胞遺傳背景相似但淋巴道轉移潛能不同，ANXA3在Hca-F和Hca-P細胞株中均高豐度表達但又有差異，是研究ANXA3與肝癌腫瘤淋巴道轉移發(fā)生發(fā)展的理想模型。
　　目的:1、構建pGPU6/GFP/Neo-

2、shRNA-Anxa3表達載體，穩(wěn)定轉染Hca-F和Hca-P細胞，篩選ANXA3穩(wěn)定下調的Hca-F和Hca-P單克隆細胞株;2、構建pEGFP-N1-Anxa3和pcDNA3.1/V5-His B-Anxa3真核表達載體，瞬時轉染并在Hca-P細胞中過表達ANXA3;3、考察ANXA3下調對Hca-F細胞體外增殖、遷移和侵襲的影響;4、考察ANXA3下調對Hca-P細胞體外增殖、克隆形成、遷移、侵襲及耐藥性的影響;5、研究ANXA3

3、的亞細胞定位;6、考察ANXA3過表達對Hca-P細胞體外增殖、克隆形成、遷移及侵襲的影響;7、系統(tǒng)研究ANXA3調控Hca-F和Hca-P細胞惡性表型的分子調控機制。
　　方法:1、利用在線軟件設計Anxa3基因的shRNA及無關序列(NC，陰性對照)，構建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Anxa3及pGPU6/GFP/Neo-shRNA-NC表達載體;2、采用脂質體轉染方法，將pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A

4、nxa3/NC表達載體轉染至Hca-F和Hca-P細胞，G418抗性篩選及有限稀釋法獲得ANXA3穩(wěn)定下調的單克隆細胞株，計算ANXA3下調效率;3、自行設計引物，利用基因工程方法構建pEGFP-N1-Anxa3和pcDNA3.1/V5-His B-Anxa3過表達載體，瞬時轉染Hca-P細胞;4、CCK-8法分析ANXA3下調對Hca-F和Hca-P細胞，ANXA3過表達對Hca-P細胞增殖能力的影響;軟瓊脂克隆實驗考察ANXA3下調

5、及過表達對Hca-P細胞克隆形成能力的影響;5、Transwell小室法分析ANXA3的表達對Hca-F和Hca-P細胞遷移侵襲能力的影響;6、CCK-8結合Hoechst33258凋亡染色分析ANXA3下調對Hca-P細胞耐藥性及抗順鉑誘導凋亡的影響;7、激光掃描共聚焦實驗確定ANXA3蛋白表達的亞細胞定位;8、Western Blot確定ANXA3調控Hca-F和Hca-P細胞惡性行為信號轉導通路中相關分子水平變化。
　　結果

6、:1、成功構建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Anxa3/NC表達載體，獲得ANXA3穩(wěn)定下調的F-ANXA3-shRNA、P-ANXA3-shRNA1和P-ANXA3-shRNA2單克隆細胞株;2、酶切及測序結果表明，pEGFP-N1-Anxa3和pcDNA3.1/V5-His B-Anxa3過表達載體構建成功;3、F-ANXA3-shRNA細胞的體外增殖、遷移和侵襲能力分別是陰性對照組的1.62、1.59和2.98倍，ANX

7、A3下調通過激活Erk通路和PI3K/Akt通路增強Hca-F細胞的惡性表型;4、P-ANXA3-shRNA1(2)細胞的體外增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力分別是陰性對照組的1.13(1.08)、4.06(4.86)、4.98(4.75)和2(2.77)倍，ANXA3下調通過激活Erk和JNK通路增強Hca-P細胞的惡性表型;5、ANXA3過表達后，陰性對照組細胞體外增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力分別提升為上調組的1.19、1.32、2

8、.92和3.4倍，ANXA3的過表達通過抑制Erk和JNK通路來抑制Hca-P細胞的惡性表型;6、激光掃描共聚焦實驗結果表明ANXA3蛋白表達主要集中于細胞質中;7、ANXA3下調增強了Hca-P細胞對順鉑的耐藥性，對5-FU耐藥性無明顯影響，ANXA3通過內源性凋亡途徑調控Hca-P細胞的cisplatin的耐藥性。
　　結論:1、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Anxa3/NC、pEGFP-N1-Anxa3和pcDNA

9、3.1/V5-HisB-Anxa3真核表達載體成功構建;2、獲得了ANXA3表達穩(wěn)定下調的單克隆細胞株;3、ANXA3的下調通過激活Erk通路和PI3K/Akt通路促進Hca-F細胞的體外增殖、遷移和侵襲惡性表型;4、ANXA3的下調增強Hca-P細胞體外增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力，相反，ANXA3的過表達抑制Hca-P細胞體外增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力，主要通過調控Erk和JNK通路來實現(xiàn);5、ANXA3蛋白表達主要集中于細胞