抑癌基因Arid2調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖及相關(guān)分子機(jī)制.pdf

1、目的：Arid2是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，定位于第12對(duì)染色體的長(zhǎng)臂，包含21個(gè)外顯子。Arid2是SWI/SNF復(fù)合物的一種特有亞基，而該復(fù)合物是一種依賴ATP酶的染色質(zhì)重塑復(fù)合物，可以通過(guò)水解ATP獲得的能量，改變組蛋白與核小體之間的相互作用進(jìn)而改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)象，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程。人類Arid家族包含15個(gè)成員，可分為七個(gè)亞家族：Arid1~5，JArid1和JArid2。近年的研究表明Arid2等組成的

2、蛋白復(fù)合物SWI/SNF具有腫瘤抑制作用，其可能的途徑如下：1）通過(guò)調(diào)控IFN信號(hào)通路調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答；2）通過(guò)Rb-E2F信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞的增殖；3）調(diào)控細(xì)胞骨架蛋白、跨膜糖蛋白如ROCK1和CD44的表達(dá)參與調(diào)控細(xì)胞的遷移與侵襲力。
　　Arid家族的突變失活與人類多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，如肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)，黑色素瘤，非小細(xì)胞型肺癌以及頭頸部癌等。在丙型肝炎病毒(HCV)

3、感染相關(guān)的HCC中，約18.2％的HCC組織標(biāo)本存在Arid2的失活突變。
　　此外，Arid2還可以影響早期發(fā)育，在胚胎形成階段Arid2的突變可以導(dǎo)致多種心臟缺陷包括室間隔缺損、完全性房室間隔缺損等。但到目前為止，Arid2基因的生物學(xué)功能尚不明確，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展特別是肝細(xì)胞肝癌中的作用仍知之甚少。因此本研究擬在體外肝癌細(xì)胞中觀察抑癌基因Arid2對(duì)細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，并在荷瘤鼠模型中觀察Arid2對(duì)于體內(nèi)成瘤的影響，并探

4、索Arid2在腫瘤發(fā)生中所起的作用及其相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法：RT-PCR及Western blot技術(shù)檢測(cè)人肝癌組織標(biāo)本和不同的肝癌細(xì)胞中Arid2基因的表達(dá)情況；構(gòu)建沉默Arid2和過(guò)表達(dá)Arid2的重組腺病毒，通過(guò) MTS及 Transwell實(shí)驗(yàn)觀察給予 siArid2及過(guò)表達(dá)Arid2處理后肝癌細(xì)胞增殖、遷移能力的改變；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) Arid2對(duì)于肝癌細(xì)胞周期的影響；進(jìn)一步通過(guò)荷瘤鼠實(shí)驗(yàn)觀察Arid2對(duì)于體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)

5、轉(zhuǎn)移的影響，免疫組化檢測(cè)裸鼠移植瘤中c-myc、β-catenin、ki-67及cyclinD1的表達(dá)，驗(yàn)證體外細(xì)胞模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；并運(yùn)用熒光定量PCR和Western blot技術(shù)分別檢測(cè)給予沉默Arid2和過(guò)表達(dá)Arid2后Rb-E2F信號(hào)通路上下游信號(hào)分子的表達(dá)變化，IP實(shí)驗(yàn)觀察Arid2與轉(zhuǎn)錄因子E2F1、E2F4是否具有直接的相互作用，并通過(guò)ChIP研究Arid2參與細(xì)胞周期調(diào)控的可能分子機(jī)制。
　　結(jié)果：RT-PCR及

6、Western blot均證實(shí)，腫瘤組織中Arid2的表達(dá)明顯低于癌旁組織，在呈現(xiàn)明顯的低表達(dá)。細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示，沉默Arid2可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移及細(xì)胞周期由G1期向S期的轉(zhuǎn)換，反之給予過(guò)表達(dá)Arid2處理后，細(xì)胞增殖及遷移受到明顯的抑制，細(xì)胞停滯在G1期。
　　荷瘤鼠皮下成瘤及肝臟原位成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Arid2可以明顯延緩體內(nèi)腫瘤的形成速度，抑制腫瘤的成瘤率及生長(zhǎng)速度，同時(shí)還能抑制相關(guān)基因如 ki-67、c-myc、β

7、-catenin以及細(xì)胞周期蛋白 cyclinD1的表達(dá)。沉默Arid2則能明顯促進(jìn)移植瘤的生長(zhǎng)和大小，上調(diào)上述細(xì)胞增殖及侵襲指標(biāo)分子的表達(dá)。
　　Western blot和熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)顯示，Arid2可以下調(diào)Rb-E2F通路重要分子如pRb、E2F1、cyclinD1、cyclinE1的表達(dá)，IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Arid2蛋白可以與E2F1、E2F4直接結(jié)合，ChIP實(shí)驗(yàn)表明，Arid2可以抑制E2F1轉(zhuǎn)錄復(fù)合物在下游靶基因啟動(dòng)子

8、區(qū)的募集，同時(shí)增強(qiáng) E2F4復(fù)合物在上述區(qū)域的富集。
　　結(jié)論：Arid2可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖以及腫瘤的生長(zhǎng)，其機(jī)制可能是調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程，抑制細(xì)胞進(jìn)入分裂期，具體調(diào)控的方式：1）抑制激活性轉(zhuǎn)錄因子E2F1的表達(dá)并促進(jìn)阻滯性轉(zhuǎn)錄因子E2F4的表達(dá)；2）抑制E2F1-pRb募集到下游靶基因啟動(dòng)子區(qū)，同時(shí)促進(jìn)E2F4-p130在靶基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合；3）抑制細(xì)胞周期蛋白 cyclinD1、cyclinE1的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)闡明了Ari