抑癌基因Arid2對(duì)HBV病毒復(fù)制的調(diào)控及分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：乙型病毒性肝炎（Hepatitis B virus，HBV）是一種嚴(yán)重危害人類健康和生命的傳染性疾病，每年大約有100萬人死于HBV相關(guān)性疾病。
　　哺乳動(dòng)物酵母交換型轉(zhuǎn)換/蔗糖不發(fā)酵復(fù)合物(Yeast mating-type switching/sucrose non-fermenting, SWI/SNF)是一種進(jìn)化保守的多亞基染色質(zhì)重塑復(fù)合物，其核心亞單位BRG1或BRM具有ATP酶活性。SWI/SNF復(fù)合物利用ATP

2、水解所釋放的能量動(dòng)員核小體改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)從而調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄。人類的 SWI/SNF復(fù)合物分兩個(gè)亞型BAF(BRG1/hBRM-associated factors)和PBAF(Polybromo-associated BAF)，兩者僅有幾個(gè)組成亞基不同。Arid2基因編碼的BAF200是新近發(fā)現(xiàn)的SWI/SNF復(fù)合物核心亞單位PBAF中的一種特異性亞基。
　　研究表明，病毒復(fù)制的過程同樣需要核染色質(zhì)重塑蛋白的參與，而作為PBAF中

3、的一種特異性亞基，Arid2對(duì)病毒的復(fù)制也具有重要的調(diào)控作用，Easley等發(fā)現(xiàn)Arid2能夠影響人類免疫缺陷病毒長末端重復(fù)序列（The human immunodeficiency virus type1 long terminal repeat，HIV LTR）的轉(zhuǎn)錄活性從而調(diào)控病毒的復(fù)制。但是Arid2對(duì)HBV感染細(xì)胞中病毒復(fù)制的調(diào)控作用還未見相關(guān)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)旨在HBV穩(wěn)定復(fù)制的細(xì)胞系（HepG2-HBV1.1和HepG2.2.1

4、5）中觀察Arid2能否調(diào)控HBV的復(fù)制，并進(jìn)一步探尋Arid2調(diào)控HBV復(fù)制的相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法:1)在HBV復(fù)制的穩(wěn)定細(xì)胞系中通過Western blot和Southern blot檢測(cè)Arid2表達(dá)水平和HBV復(fù)制水平的相關(guān)性。2）在HBV穩(wěn)定復(fù)制的肝癌細(xì)胞系（HepG2-HBV1.1和HepG2.2.15）中，通過Southern blot、Western blot、qRT-PCR和ELISA法觀察沉默或過表達(dá)Ari

5、d2后HBV復(fù)制水平的變化。3）通過RT-PCR和qRT-PCR篩選沉默或過表達(dá)Arid2后可能影響HBV復(fù)制的轉(zhuǎn)錄因子，并進(jìn)一步通過免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）、染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)（chromatin immunoprecipitation，ChIP）深入研究Arid2調(diào)控HBV復(fù)制的分子機(jī)制。
　　結(jié)果：Western blot和Southern blot結(jié)果表明，在HBV穩(wěn)定復(fù)制的

6、肝癌細(xì)胞系（HepG2.2.15、HepG2-HBV1.1和HepAD38）中， HBV的復(fù)制水平和 Arid2基因的表達(dá)水平呈正相關(guān)。qRT-PCR和 Southern blot結(jié)果證實(shí)：沉默Arid2基因的表達(dá)后，細(xì)胞內(nèi)的HBV DNA拷貝量、pgRNA和HBcAg的表達(dá)量比對(duì)照組明顯降低（P<0.05）； ELISA方法檢測(cè)到 siArid2組細(xì)胞上清中 HBeAg表達(dá)降低（P<0.05），但上清中HBsAg的表達(dá)量與對(duì)照組無明顯

7、差異（P>0.05）。通過RT-PCR篩選與HBV復(fù)制相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，我們發(fā)現(xiàn)沉默Arid2基因的表達(dá)后，細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子PGC-1α的表達(dá)明顯下調(diào)。ChIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，轉(zhuǎn)錄因子PGC-1α能夠與HBV增強(qiáng)子結(jié)合，且主要與HBV EnhancerⅡ結(jié)合為主，沉默Arid2后轉(zhuǎn)錄因子PGC-1α與HBV增強(qiáng)子的結(jié)合水平明顯下降。Co-IP實(shí)驗(yàn)表明，Arid2蛋白不能與轉(zhuǎn)錄因子PGC-1α直接結(jié)合。反之，在過表達(dá)Arid2的細(xì)胞模型中，實(shí)驗(yàn)

8、組細(xì)胞內(nèi)的HBV DNA拷貝量、pgRNA和HBcAg的表達(dá)量與細(xì)胞上清中的HBeAg表達(dá)量比對(duì)照組明顯增加，同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子PGC-1α的表達(dá)量也明顯增加。ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)過表達(dá)Arid2后PGC-1α與HBV增強(qiáng)子的結(jié)合水平明顯增加。
　　結(jié)論：在HBV復(fù)制狀態(tài)下，Arid2的表達(dá)水平與HBV復(fù)制水平呈正相關(guān)。Arid2主要通過調(diào)控PGC-1α的表達(dá)，并增強(qiáng)PGC-1α與HBV轉(zhuǎn)錄調(diào)控核心啟動(dòng)子區(qū)EnhancerⅡ的結(jié)合來