APOBEC3B抑制HBV復(fù)制的分子機(jī)制.pdf

1、目的：HBV病毒是一種嗜肝DNA病毒，以逆轉(zhuǎn)錄方式進(jìn)行復(fù)制。APOBEC3B是一種天然免疫分子，具有清除外源病毒或內(nèi)源轉(zhuǎn)座子的能力，在宿主的防御過程中起著重要的作用。最近研究報(bào)道表明APOBEC3B能對(duì)HBV cccDNA進(jìn)行脫氨基作用，氨基化的cccDNA通過UNG家族蛋白所介導(dǎo)的BER修復(fù)途徑降解。由于APOBEC3B是細(xì)胞內(nèi)的穿梭蛋白，除了在核內(nèi)作用于cccDNA外，APOBEC3B能否在HBV復(fù)制的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)發(fā)揮抑制作用尚不清楚

2、。因此，本文重點(diǎn)研究了宿主限制性因子APOBC3B在逆轉(zhuǎn)錄過程中抑制HBV復(fù)制的分子機(jī)制，其研究結(jié)果有助于進(jìn)一步闡明APOBC3B抑制HBV的分子機(jī)制，并以此為靶點(diǎn)篩選新的抗病毒藥物。
　　方法：
　?。?）APOBEC3B抑制 HBV復(fù)制的表型和功能研究：利用HBV轉(zhuǎn)染－復(fù)制系統(tǒng)，在HepG2.0細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染外源表達(dá)APOBEC3B和HBV A、B、C、D四種不同基因型表達(dá)質(zhì)粒，Southern blot檢測(cè)了APOBEC

3、3B對(duì)四種HBV四種基因型的抑制作用；研究了APOBEC3B對(duì) HBV基因型 D相關(guān)復(fù)制參數(shù)的檢測(cè)：ELISA檢測(cè)了細(xì)胞上清中HBsAg表達(dá)水平，qPCR檢測(cè)了HBV核心顆粒DNA和cccDNA的表達(dá)水平；應(yīng)用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建了APOBEC3B羧基端脫氨酶活性位點(diǎn)H253R突變體，ELISA檢測(cè)了細(xì)胞上清中HBsAg的恢復(fù)情況、qPCR檢測(cè)了Core DNA的水平變化，Southern blot驗(yàn)證了APOBEC3B羧基端的抗病毒作用，

4、3D PCR和克隆測(cè)序研究了APOBEC3B對(duì)HBV病毒顆粒DNA發(fā)生的脫氨基作用；根據(jù)APOBEC3B羧基端的三維結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了羧基端活性中心附近的三個(gè)螺旋區(qū)段(α2,α3,α4)的缺失突變體和α4螺旋區(qū)內(nèi)(D316A,K320A,E321A,R327A,D328A)位點(diǎn)的突變體，Southern blot篩選了參與APOBEC3B抑制HBV復(fù)制的重要區(qū)段和關(guān)鍵位點(diǎn)，3D PCR和克隆測(cè)序進(jìn)行了驗(yàn)證。進(jìn)一步研究了APOBEC3B對(duì)病毒在

5、逆轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)形成的復(fù)制中間體（包括病毒DNA和RNA）的脫氨基作用進(jìn)行分析：Southern blot驗(yàn)證了HBV聚合酶突變體YMHA和RNAseH酶突變體D702A突變體構(gòu)建成功，3D-PCR和克隆測(cè)序研究了APOBEC3B對(duì)HBV逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制環(huán)節(jié)中的病毒顆粒負(fù)鏈DNA、正鏈DNA和pgRNA發(fā)生的脫氨基作用。
　?。?）APOBEC3B在逆轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)與病毒蛋白相互作用抑制HBV復(fù)制的機(jī)制研究：首先免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)了APOBEC3B的

6、細(xì)胞內(nèi)定位，超速離心提取HBV病毒顆粒檢測(cè)了APOBEC3B在細(xì)胞漿中病毒顆粒內(nèi)的表達(dá)，提取細(xì)胞核漿蛋白分析了APOBEC3B的核漿分布；然后分析了APOBEC3B與病毒蛋白的相互作用：免疫共沉淀試驗(yàn)檢測(cè)了APOBEC3B與HBV Core蛋白和P蛋白的相互作用，并用RNase A處理分析這種作用是否依賴于RNA，根據(jù)APOBEC3B的結(jié)構(gòu)域構(gòu)建了 APOBEC3B的五個(gè)區(qū)段缺失突變體（△10-65AA、△66-100AA、△124-1

7、94AA、△253-284AA、△289-373AA），免疫共沉淀檢測(cè)了APOBEC3B與P蛋白的結(jié)合區(qū)段，Southern blot檢測(cè)了此區(qū)段的抗病毒作用。
　　結(jié)果：
　?。?）APOBEC3B抑制HBV復(fù)制的表型和功能研究：HepG2.0細(xì)胞中過表達(dá)外源的APOBC3B明顯對(duì)細(xì)胞無毒性；APOBEC3B能夠顯著抑制HBV A、B、C、D四種HBV基因型的復(fù)制；APOBEC3B顯著抑制HBV基因型D上清中HBsAg、病

8、毒顆粒DNA和cccDNA表達(dá)水平；APOBEC3B羧基端脫氨酶活性位點(diǎn) H253位點(diǎn)突變后，喪失了對(duì)病毒DNA的抑制作用，表明APOBC3B依賴于脫氨酶方式抑制病毒復(fù)制，同時(shí)H253位點(diǎn)是APOBEC3B重要的脫氨酶活性和抗病毒活性位點(diǎn)，進(jìn)一步通過3D PCR和克隆測(cè)序表明APOBEC3B對(duì)HBV核心顆粒中的DNA誘導(dǎo)了大量的G-A突變，這種G-A突變主要以5’-GpA-3’的二聯(lián)核苷酸的形式；最后通過Southern blot和3D

9、-PCR篩選APOBEC3B羧基端脫氨酶活性中心的結(jié)構(gòu)域表明α3和α4螺旋區(qū)缺失后，其抗病毒活性消失，并且α4區(qū)域的D316位點(diǎn)突變后，APOBEC3B的脫氨酶活性和抗病毒活性消失；APOBEC3B對(duì)HBV負(fù)鏈DNA發(fā)生編輯作用，形成大量的G-A突變，對(duì)HBV正鏈DNA進(jìn)行編輯作用，形成少量的C-T突變，H253脫氨酶活性位點(diǎn)突變后，這種編輯形成的突變消失；APOBEC3B主要作用于HBV負(fù)鏈DNA的X區(qū)段，具有序列特異性；APOBCE

10、3B對(duì)病毒pgRNA不發(fā)揮編輯作用。
　?。?）APOBEC3B在逆轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)與病毒蛋白相互作用抑制HBV復(fù)制的機(jī)制研究：細(xì)胞組分定位分析表明APOBEC3B大部分分布于細(xì)胞核，少量分布于細(xì)胞質(zhì)，核定位信號(hào)區(qū)突變后，APOBC3B位于細(xì)胞質(zhì)中，并通過依賴于脫氨酶方式抑制HBV復(fù)制；免疫共沉淀表明APOBEC3B與HBV核心蛋白Core發(fā)生相互結(jié)合作用，并且這種結(jié)合依賴RNA；APOBEC3B與HBV聚合酶P發(fā)生相互結(jié)合作用，且APO

11、BEC3B蛋白氨基端的（124AA-194AA殘基）是APOBEC3B與HBVP蛋白發(fā)生相互作用的重要區(qū)段。
　　結(jié)論：APOBEC3B是一種天然抗病毒免疫因子，能夠通過脫氨基作用抑制HBV復(fù)制；羧基端D316位點(diǎn)是APOBEC3B脫氨酶和抗病毒的關(guān)鍵位點(diǎn)；APOBEC3B可以與HBV Core蛋白相互結(jié)合促進(jìn)APOBEC3B包裝進(jìn)入病毒顆粒，在HBV逆轉(zhuǎn)錄過程中結(jié)合pgRNA和HBVP蛋白，然后編輯病毒的負(fù)鏈DNA和正鏈DNA，