RNAi技術(shù)在抑制HBV復(fù)制和表達中的應(yīng)用.pdf

1、乙型肝肝炎病毒(HBV)是一種長3.2Kb的DNA病毒，它幾乎在整個肝臟可以復(fù)制。雖然高活性的乙肝疫苗已問世20多年，但HBV感染仍然是一種危害全球健康的重大疾病。據(jù)統(tǒng)計全球約有3.5億的HBV感染者，而中國又是HBV感染的高發(fā)區(qū)，約有50％～70％的人群感染過HBV，其中約8％～12％的人群，即超過1億人口是乙肝表面抗原攜帶者，每年因急慢性HBV感染致死的人數(shù)約有一百萬之多。目前，干擾素和腺苷類似物是FDA批準(zhǔn)的，僅有的幾種抑制HBV

2、復(fù)制的藥物，但它們的作用效果都很有限。腺苷類似物如lamivudine和adefovirdipivoxil的作用原理是通過抑制HBV逆轉(zhuǎn)錄活性，而直接影響病毒復(fù)制的，雖然這類藥物能高效地清除血清中的HBV-DNA，但不能完全清除體內(nèi)感染的HBV，因此停止用藥后HBV會復(fù)發(fā)，并且用藥時間的延長會導(dǎo)致HBV病毒突變體的產(chǎn)生。 RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術(shù)是指內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的，

3、細(xì)胞內(nèi)mRNA發(fā)生特異性降解，并導(dǎo)致靶基因的表達沉默，產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失的一種現(xiàn)象。這一現(xiàn)象屬于轉(zhuǎn)錄后的基因沉默機制(Posttranscriptionalgenesilencing，PTGS)。在哺乳動物細(xì)胞中RNAi活性主要是通過21～23nt長的smallinterferingRNAs(siRNA)來實現(xiàn)的。研究表明siRNA已在很多領(lǐng)域顯示出對目的基因的清除作用，因此，RNAi也成為治療HBV感染的一種可選的重要手段。

4、 自1998年2月，F(xiàn)ire和Mello兩位科學(xué)家首次在Nature上發(fā)表了：把dsRNA注射入一種線蟲(Caenorhabditiselegans)體內(nèi)，該dsRNA可以誘導(dǎo)基因靶向?qū)Ｒ恍缘幕虮磉_靜寂(genesilencing)等研究報告以來，許多研究工作者都先后用RNAi技術(shù)，在線蟲、果蠅、植物、動物卵細(xì)胞和哺乳類細(xì)胞中進行了大量研究，他們采用不同長度的dsRNA，可使不同類型細(xì)胞的靶向基因表達明顯降低，有時甚至用專一性抗體都

5、檢測不到靶向基因所表達的蛋白質(zhì)或肽類。因此，人們形象地稱用RNAi技術(shù)可使基因敲低(knockdown)或使基因靜寂。這是一種典型的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控方法，又稱轉(zhuǎn)錄后基因靜寂(PTGS)。關(guān)于sRNAi的研究報告越來越多，結(jié)果也越來越令人振奮。德國科學(xué)家Elbashir等人在Nature上發(fā)表了：將長度為21個核苷酸(21nts)的雙鏈RNA(siRNA)用于培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞，siRNA可使哺乳動物細(xì)胞的靶基因表達明顯降低。隨后他們又在2

6、001年12月CellScience詳細(xì)介紹了siRNA技術(shù)，并利用該技術(shù)分別使16個靶基因表達降低或靜寂，從而引起了更廣泛的關(guān)注。一些科學(xué)家預(yù)測，由于這種RNAi技術(shù)比基因敲除技術(shù)更方便快捷地顯示出基因的功能，因此，有希望用于治療某些由于特定基因表達過度引起的疾病，或者由病毒或寄生病原性蛋白表達引起的疾病。尤其有希望用于治療癌基因或突變基因引起的癌癥。 本研究分別通過體外合成和體內(nèi)載體表達兩種途徑獲得雙鏈siRNA，然后研究其

7、對哺乳動物細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制和表達的抑制作用。首先針對HBV基因組序列設(shè)計分別靶向于S基因區(qū)、C基因區(qū)和P基因區(qū)的siRNA序列，用BLAST軟件分析所設(shè)計的siRNA與人類基因的同源性，結(jié)果顯示設(shè)計的siRNA和人類基因沒有完全同源之處(不會引起人類相關(guān)基因靜默)。然后依照此序列由Invitrogen公司合成siRNA，并化學(xué)修飾得到StealthsiRNA，他們分別是stealth_508靶向HBV基因組的S區(qū)和P區(qū)(nt508-53

8、2)，stealth2311靶向HBV基因組的C區(qū)(nt2311-2335)，stealth2765靶向HBV基因組的P區(qū)(nt2765-2789)。修飾后的StealthsiRNA較標(biāo)準(zhǔn)siRNA具有更好的穩(wěn)定性、不易降解，而且通過修飾消除了其正義鏈的RNAi作用，僅反義鏈具有RNAi的作用，這就大大降低了非特異性基因靜默的可能性。 2.2.15細(xì)胞是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了HBV基因組的肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，實驗選用此細(xì)胞系作為研究對象，分別

9、用脂質(zhì)體介導(dǎo)三種StealthsiRNA轉(zhuǎn)染HepG22.2.15細(xì)胞，培養(yǎng)相應(yīng)時間后，用ELISA法檢測HBV表面抗原及e抗原的表達，用熒光定量PCR檢測HBV的DNA拷貝數(shù)。 為構(gòu)建雙鏈siRNA的真核細(xì)胞表達載體，以人基因組DNA為模板擴增人U6啟動子，并在兩端引入EcoRⅠ和SmaⅠ酶切位點，通過此酶切位點將U6啟動子重組到pUC18載體中，構(gòu)建真核細(xì)胞shRNA表達載體pU6。在真核細(xì)胞中U6啟動子可以使其后DNA序列

10、轉(zhuǎn)錄成RNA。依照StealthsiRNA的序列，采用兩套方案將與之對應(yīng)的shRNA的DNA序列插入載體pU6。一種方案是直接合成雙鏈DNA，兩端分別為SmaⅠ和HindⅢ酶切末端，載體pU6經(jīng)對應(yīng)酶酶切后，與合成的雙鏈DNA進行連接就可獲得針對HBV的shRNA表達質(zhì)粒pU6/HBVi。另一種方案是利用PCR延伸技術(shù)，上游用一條與U6啟動子結(jié)合的引物，下游分別用兩條引物(第一條能與U6啟動子結(jié)合)分兩次將針對HBV的shRNA的DNA

11、序列延伸到U6啟動子的下游，同時在兩端分別引入EcoRⅠ(上游引物)和HindⅢ(下游第二條引物)的酶切位點，最后將第二次擴增產(chǎn)物和載體經(jīng)相應(yīng)內(nèi)切酶酶切、連接、就獲得針對HBV的shRNA表達質(zhì)粒pU6/HBVi。 實驗中，我們采用兩種不同的方法構(gòu)建了針對HBV的shRNA表達質(zhì)粒pU6/HBVi。第一種方法是傳統(tǒng)的構(gòu)建模式，優(yōu)點是快速準(zhǔn)確，但插入的shRNA序列受酶切位點的限制，因必須保證U6啟動子與插入的shRNA序列之間沒

12、有無關(guān)堿基。第二種方法的優(yōu)點是可插入任意序列的shRNA，但因為引入shRNA序列的引物有發(fā)卡結(jié)構(gòu)，PCR條件不易優(yōu)化。 此外，我們還利用pUC19將shRNA的表達框(shRNAExpressionCassette，SEC)在載體中的方向進行了調(diào)換，構(gòu)建了針對HBV的shRNA表達質(zhì)粒pU6B/HBVi。最后將構(gòu)建好的針對HBV的shRNA表達質(zhì)粒pU6/HBVi和pU6B/HBVi，以脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染2.2.15細(xì)胞，培養(yǎng)相應(yīng)

13、時間后，用ELISA法檢測HBV表面抗原及e抗原的表達，用熒光定量PCR檢測HBV的DNA拷貝數(shù)。 ELISA檢測結(jié)果顯示，用StealthsiRNA及構(gòu)建的質(zhì)粒pU6B/HBVi轉(zhuǎn)染2.2.15細(xì)胞后，實驗組與對照組比較，實驗組細(xì)胞中的HBV表面抗原及e抗原的表達均被顯著性抑制；熒光定量PCR檢測檢測結(jié)果顯示，實驗組細(xì)胞中HBV的復(fù)制也被顯著性抑制，甚至HBVDNA可被完全清除。 綜上所述，我們設(shè)計的Stealthsi

14、RNA及構(gòu)建的針對HBV的shRNA表達質(zhì)粒pU6B/HBVi，對HBV的復(fù)制和表達均有顯著性的抑制作用，這為臨床HBV的生物治療奠定了實驗基礎(chǔ)，也為HBV的治療提供了一種新途徑；同時，我們構(gòu)建的真核細(xì)胞shRNA表達載體pU6為RNA干擾技術(shù)提供了一種新的可選擇的技術(shù)平臺。 目前，盡管RNAi技術(shù)仍有一些問題尚未解決：如給藥途徑及安全性等問題，但RNAi這一新技術(shù)還是為相關(guān)疾病的治療研究及新藥研發(fā)，開拓了一個全新方向。一旦RN