應(yīng)用RNAi文庫(kù)篩選HBV復(fù)制相關(guān)基因.pdf

1、目的：應(yīng)用RNAi文庫(kù)建立一種篩選HBV復(fù)制相關(guān)基因的方法，篩選參與HBV復(fù)制的基因，為探討HBV復(fù)制的機(jī)理，開發(fā)抗乙肝病毒新藥提供新的靶點(diǎn)。 方法：（1）建立并驗(yàn)證篩選策略：構(gòu)建HBx-siRNA及HBs-siRNA并感染HepG2.2.15細(xì)胞，MEIA法檢測(cè)細(xì)胞上清中HBsAg，HBeAg的表達(dá)量，定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞上清中HBV DNA及細(xì)胞內(nèi)cccDNA的含量，F(xiàn)ACS檢測(cè)細(xì)胞表面HBsAg的表達(dá)水平。（2）基因篩

2、選并驗(yàn)證：將RNAi文庫(kù)感染HepG2.2.15細(xì)胞，利用免疫磁珠收集HBsAg表達(dá)降低的細(xì)胞，提取DNA，PCR擴(kuò)增siRNA編碼序列，將PCR產(chǎn)物克隆入T-easy，隨機(jī)挑選單克隆測(cè)序后選取感興趣的基因，合成其相應(yīng)的siRNA轉(zhuǎn)入HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證。Western blot檢測(cè)被抑制基因編碼的蛋白表達(dá)水平，MEIA法及定量RT-PCR檢測(cè)HBV復(fù)制情況，F(xiàn)ACS檢測(cè)細(xì)胞表面HBsAg的表達(dá)水平。 結(jié)果：（1）

3、HBx-siRNA及HBs-siRNA感染HepG2.2.15細(xì)胞后細(xì)胞上清中病毒蛋白（HBsAg，HBeAg）及HBV DNA表達(dá)量均低于對(duì)照組，細(xì)胞內(nèi)cccDNA的相對(duì)表達(dá)量也較對(duì)照組下降。FACS結(jié)果提示抑制HBx或HBs的表達(dá)均能夠降低HepG2.2.15細(xì)胞表面HBsAg的表達(dá)量。（2）在隨機(jī)挑選的克隆中成功測(cè)序20個(gè)，其中一個(gè)克隆含有DDB1的編碼序列（可能參與HBV復(fù)制），另一個(gè)克隆含有KIAA1919的編碼序列，余下18

4、個(gè)克隆的序列不能定位于任何基因。構(gòu)建DDB1-siRNA并轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞后Western blot檢測(cè)顯示DDB1蛋白被抑制；MEIA法及定量RT-PCR顯示細(xì)胞上清中病毒蛋白（HBsAg，HBeAg）及HBVDNA表達(dá)量均低于對(duì)照組；細(xì)胞內(nèi)cccDNA的相對(duì)表達(dá)量較轉(zhuǎn)染前明顯下降；FACS結(jié)果也顯示抑制DDB1的表達(dá)能夠降低HepG2.2.15細(xì)胞表面HBsAg的表達(dá)量。 結(jié)論：本試驗(yàn)建立了一種篩選HBV復(fù)制相關(guān)