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文檔簡介
1、目的:應用RNAi文庫建立一種篩選HBV復制相關基因的方法,篩選參與HBV復制的基因,為探討HBV復制的機理,開發(fā)抗乙肝病毒新藥提供新的靶點。 方法:(1)建立并驗證篩選策略:構建HBx-siRNA及HBs-siRNA并感染HepG2.2.15細胞,MEIA法檢測細胞上清中HBsAg,HBeAg的表達量,定量RT-PCR檢測細胞上清中HBV DNA及細胞內cccDNA的含量,FACS檢測細胞表面HBsAg的表達水平。(2)基因篩
2、選并驗證:將RNAi文庫感染HepG2.2.15細胞,利用免疫磁珠收集HBsAg表達降低的細胞,提取DNA,PCR擴增siRNA編碼序列,將PCR產物克隆入T-easy,隨機挑選單克隆測序后選取感興趣的基因,合成其相應的siRNA轉入HepG2.2.15細胞內進行驗證。Western blot檢測被抑制基因編碼的蛋白表達水平,MEIA法及定量RT-PCR檢測HBV復制情況,FACS檢測細胞表面HBsAg的表達水平。 結果:(1)
3、HBx-siRNA及HBs-siRNA感染HepG2.2.15細胞后細胞上清中病毒蛋白(HBsAg,HBeAg)及HBV DNA表達量均低于對照組,細胞內cccDNA的相對表達量也較對照組下降。FACS結果提示抑制HBx或HBs的表達均能夠降低HepG2.2.15細胞表面HBsAg的表達量。(2)在隨機挑選的克隆中成功測序20個,其中一個克隆含有DDB1的編碼序列(可能參與HBV復制),另一個克隆含有KIAA1919的編碼序列,余下18
4、個克隆的序列不能定位于任何基因。構建DDB1-siRNA并轉染HepG2.2.15細胞后Western blot檢測顯示DDB1蛋白被抑制;MEIA法及定量RT-PCR顯示細胞上清中病毒蛋白(HBsAg,HBeAg)及HBVDNA表達量均低于對照組;細胞內cccDNA的相對表達量較轉染前明顯下降;FACS結果也顯示抑制DDB1的表達能夠降低HepG2.2.15細胞表面HBsAg的表達量。 結論:本試驗建立了一種篩選HBV復制相關
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