應用RNAi文庫篩選HBV復制相關基因.pdf

1、目的：應用RNAi文庫建立一種篩選HBV復制相關基因的方法，篩選參與HBV復制的基因，為探討HBV復制的機理，開發(fā)抗乙肝病毒新藥提供新的靶點。 方法：（1）建立并驗證篩選策略：構建HBx-siRNA及HBs-siRNA并感染HepG2.2.15細胞，MEIA法檢測細胞上清中HBsAg，HBeAg的表達量，定量RT-PCR檢測細胞上清中HBV DNA及細胞內cccDNA的含量，FACS檢測細胞表面HBsAg的表達水平。（2）基因篩

2、選并驗證：將RNAi文庫感染HepG2.2.15細胞，利用免疫磁珠收集HBsAg表達降低的細胞，提取DNA，PCR擴增siRNA編碼序列，將PCR產物克隆入T-easy，隨機挑選單克隆測序后選取感興趣的基因，合成其相應的siRNA轉入HepG2.2.15細胞內進行驗證。Western blot檢測被抑制基因編碼的蛋白表達水平，MEIA法及定量RT-PCR檢測HBV復制情況，FACS檢測細胞表面HBsAg的表達水平。 結果：（1）

3、HBx-siRNA及HBs-siRNA感染HepG2.2.15細胞后細胞上清中病毒蛋白（HBsAg，HBeAg）及HBV DNA表達量均低于對照組，細胞內cccDNA的相對表達量也較對照組下降。FACS結果提示抑制HBx或HBs的表達均能夠降低HepG2.2.15細胞表面HBsAg的表達量。（2）在隨機挑選的克隆中成功測序20個，其中一個克隆含有DDB1的編碼序列（可能參與HBV復制），另一個克隆含有KIAA1919的編碼序列，余下18

4、個克隆的序列不能定位于任何基因。構建DDB1-siRNA并轉染HepG2.2.15細胞后Western blot檢測顯示DDB1蛋白被抑制；MEIA法及定量RT-PCR顯示細胞上清中病毒蛋白（HBsAg，HBeAg）及HBVDNA表達量均低于對照組；細胞內cccDNA的相對表達量較轉染前明顯下降；FACS結果也顯示抑制DDB1的表達能夠降低HepG2.2.15細胞表面HBsAg的表達量。 結論：本試驗建立了一種篩選HBV復制相關