攜帶外源基因的復(fù)制型HBV載體的構(gòu)建.pdf

1、背景和目的:
　　將病毒載體設(shè)計(jì)成能夠攜帶外源基因并按著親代病毒的侵入路徑到達(dá)細(xì)胞體內(nèi)的病毒變異體是病毒載體研究的新思路。對一些病毒家族來說,攜帶報(bào)告基因的復(fù)制型載體能夠在簡化和量化檢測復(fù)制和感染、識別抗病毒和病毒易感細(xì)胞等方面成為有力的工具。乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV),是引起乙型病毒性肝炎的小包裹DNA病毒,原則上在這個(gè)僅有3.2kb的基因組內(nèi)插入外源基因不可避免地會影響本身的復(fù)制元件。HBV復(fù)制子通

2、過前基因組RNA(pregenomicRNA,pgRNA)逆轉(zhuǎn)錄而來,pgRNA作為雙順反子mRNA,在形成核心蛋白(C)和逆轉(zhuǎn)錄酶(Pol)方面也是必需的,C和Pol開放讀碼框架(openreadingframes,ORF)有150bp的重疊區(qū)。PolORF的下游區(qū)翻譯一般不涉及內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site,IRES)。我們設(shè)想將C、P重疊區(qū)域拉開,插入兩個(gè)IRES分別用于表達(dá)外源基因和

3、P蛋白,產(chǎn)生一個(gè)有功能的且不影響包膜蛋白表達(dá)的三順反子pgRNA。為了減少對基因組長度的影響,我們利用僅含22個(gè)nt的RNA結(jié)合基序蛋白3(RNA-binding motif protein3,Rbm3)IRES,構(gòu)建了分別攜帶399bp的殺稻瘟菌素抗性基因(blasticidin resistance,BsdR)和720bp的人綠色熒光蛋白(humanized Renilla green fluorescent protein,hrG

4、FP)的HBV載體,研究發(fā)現(xiàn)仍有復(fù)制能力,能產(chǎn)生同野生型HBV一樣的病毒蛋白,所形成的的病毒顆?？捎糜诟腥綡epRG細(xì)胞。這種新型的攜帶外源基因的HBV載體將成為研究HBV的有力工具。
　　方法:本課題分三部分進(jìn)行探討。
　　第一部分:22-ntRbm3IRES在HBV前基因組RNA上的表達(dá)活性研究
　　1、構(gòu)建攜帶CMV啟動子和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,

5、EGFP)的四種質(zhì)粒:I:pCH-EMCVIRES-EGFP(包含腦炎心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)IRES及EGFP);II:pCH-22ntIRES-EGFP(包含Rbm3IRES及EGFP);III:pCH-BsdR-22ntIRES-EGFP(為三順反子載體,依次包含Rbm3IRES,BsdR,Rbm3IRES及EGFP);IV:pCH-pATG-EGFP(包含HBVC基因N端部分與

6、EGFP)。ELISA檢測I、II、III載體轉(zhuǎn)染HepG2或Huh7細(xì)胞后72h的上清液中HBeAg的表達(dá),并觀察四種載體轉(zhuǎn)染后EGFP的表達(dá)。
　　2、構(gòu)建攜帶HBVC基因啟動子和熒光素酶基因(Renillaluciferase,RLuc)的四種質(zhì)粒:I:pHBV-EMCVIRES-RLuc(包含EMCVIRES及RLuc);II:pHBV-22ntIRES-RLuc(包含Rbm3IRES及RLuc);III:pHBV-Bsd

7、R-22ntIRES-RLuc(為三順反子載體,依次包含Rbm3IRES,BsdR,Rbm3IRES及RLuc);IV:pHBV-pATG-RLuc(包含HBVC基因N端部分與RLuc)。四種質(zhì)粒分別同對照質(zhì)粒pGL3-Control共轉(zhuǎn)染HepG2或Huh7細(xì)胞,通過雙熒光素酶檢測試劑盒測定熒光素酶值。
　　第二部分:復(fù)制型HBV載體的構(gòu)建及其表達(dá)與復(fù)制能力研究
　　構(gòu)建兩種復(fù)制型HBV載體:pCH-BsdR和pCH-hr

8、GFP。兩個(gè)質(zhì)粒和攜帶野生型HBV的質(zhì)粒pCH-3093分別轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系HepG2和Huh7細(xì)胞。通過熒光顯微鏡觀察外源基因hrGFP的表達(dá),Bsd篩選細(xì)胞克隆。Northernblot檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后RNA的表達(dá)。Westernblot、Nativewesternblot分別用于檢測HBV包膜、核心蛋白和組裝的核心顆粒。ELISA測定細(xì)胞上清液中HBsAg和HBeAg的水平。內(nèi)源性聚合酶反應(yīng)(endogenous polymera

9、se reaction,EPR)檢測功能性P蛋白表達(dá)。Southernblot檢測HBV復(fù)制中間體。熒光定量PCR法分析細(xì)胞上清液中HBVDNA含量。CsCl密度梯度離心法分離細(xì)胞上清液中的病毒顆粒。
　　第三部分:復(fù)制型HBV載體的感染特性研究
　　野生型HBV質(zhì)粒pCH-3093、pCH-BsdR和pCH-hrGFP分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,通過聚乙二醇8000沉淀上清中的重組病毒顆粒,用于感染HepRG細(xì)胞,感染8天后,

10、經(jīng)Northernblot檢測HBVRNA的水平,ELISA測定細(xì)胞上清液中的HBsAg和HBeAg。病毒顆粒與高效價(jià)HBV免疫球蛋白(hepatitis Bimmuno-globulin,HBIG)預(yù)孵育1h后再感染HepRG細(xì)胞以驗(yàn)證重組HBV顆粒是否能被抗體阻斷。
　　結(jié)果:
　　第一部分:22-ntRbm3IRES在HBV前基因組RNA上的表達(dá)活性研究
　　1、I、II、III號載體轉(zhuǎn)染HepG2和Huh7后,

11、HBeAg表達(dá)均無顯著差異。從第一組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2后觀察熒光強(qiáng)度分析,攜帶Rbm3IRES雙順反子載體(II)中Rbm3IRES的翻譯起始效率明顯強(qiáng)于EMCVIRES(I);相對于雙順反子載體(II),在三順反子載體上(III)串聯(lián)的第二個(gè)Rbm3IRES引導(dǎo)的EGFP表達(dá)強(qiáng)度下降較多;但是仍明顯高于HBV自身翻譯起始序列引導(dǎo)的EGFP表達(dá)水平(IV)。
　　2、從第二組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2和Huh7細(xì)胞后有相似的熒光素酶結(jié)

12、果,Rbm3IRES產(chǎn)生的熒光素酶活性(II)為EMCVIRES產(chǎn)生熒光素酶活性(I)的兩倍有余(IIVSI,P<0.01)。三順反子載體上Rbm3IRES產(chǎn)生的熒光素酶活性較雙順反子明顯下降(IIIVS
　　II,P<0.01),但是仍明顯高于HBV自身翻譯起始序列產(chǎn)生的熒光素酶活性(IIIVSIV,P<0.05)。
　　第二部分:復(fù)制型HBV載體的構(gòu)建及其表達(dá)與復(fù)制能力研究
　　成功構(gòu)建HBV載體pCH-BsdR和

13、pCH-hrGFP。轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能觀察到高水平綠色熒光蛋白表達(dá),經(jīng)Bsd篩選可形成穩(wěn)定的Bsd抗性細(xì)胞克隆。均可產(chǎn)生攜帶外源基因的pgRNA,有同野生型HBV相似的核心和包膜蛋白,載體之間HBsAg和HBeAg的分泌量無明顯差異。BsdR載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能翻譯出有功能的P蛋白。BsdR載體的復(fù)制能力為野生型HBV的40％,hrGFP載體復(fù)制能力明顯減弱。然而,這兩個(gè)載體都能夠形成有包膜的病毒。
　　第三部分:復(fù)制型HBV載體的感染特性

14、研究
　　利用pCH-BsdR和pCH-hrGFP能夠制備重組病毒顆粒,能夠感染HepRG細(xì)胞。感染8天后,Northernblot可以檢測到前基因組和亞基因病毒RNA,ELISA測定出同野生型HBV一樣的HBsAg和HBeAg的分泌趨勢,HBV-hrGFP病毒感染HepRG后可以檢測到hrGFP的表達(dá)。通過抗體阻斷實(shí)驗(yàn)證實(shí)重組HBV通過與野生型HBV相同的方式(通過HBV外膜蛋白)感染HepaRG細(xì)胞。
　　結(jié)論:

15、　　1、不管是用CMV啟動子還是HBVC基因啟動子驅(qū)動,Rbm3IRES都比EMCVIRES有較高的翻譯起始效率。在HBVC基因和P基因之間插入了外源基因的三順反子載體中,串聯(lián)的兩個(gè)Rbm3IRES均有能力引導(dǎo)翻譯起始過程。
　　2、把C、P蛋白分開表達(dá),利用2個(gè)僅22-nt的強(qiáng)效IRES分別表達(dá)外源基因和P蛋白,保持了各結(jié)構(gòu)蛋白的完整性又盡量少擴(kuò)充基因組容量,實(shí)現(xiàn)載體功能并保持復(fù)制能力。
　　3、利用構(gòu)建的HBV載體制備的