靶向X區(qū)的lhRNA表達載體抑制HBV基因的復(fù)制和表達.pdf

1、目的：構(gòu)建針對乙型肝炎病毒(HBV)X基因的長發(fā)卡RNA(lhRNA)表達載體,觀察其對HepG2.2.15細胞HBV基因表達和復(fù)制的影響。
　　 方法：設(shè)計并合成4條針對HBV X區(qū)基因的siRNA寡核苷酸,轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細胞,分別收集轉(zhuǎn)染后24小時、48小時、72小時的細胞培養(yǎng)上清液。通過ELISA定量檢測HBsAg濃度,熒光定量PCR法檢測上清液中HBV DNA的含量,逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測靶基

2、因mRNA的抑制效果;將篩選出的對HepG2.2.15細胞HBV基因表達和復(fù)制有抑制作用的2條siRNA分別構(gòu)建兩個表達載體,利用疊加PCR方法合成含有H1啟動子的插入片段,連接插入pMDTM18-T載體中,構(gòu)建長發(fā)夾RNA表達載體。經(jīng)酶切鑒定及測序插入成功后,重組載體轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細胞,收集轉(zhuǎn)染后48小時、72小時的細胞培養(yǎng)上清液。ELISA法定量檢測HBsAg、HBeAg濃度,熒光定量PCR法檢測上清液中HBV DNA的濃

3、度。
　　 結(jié)果：成功篩選出兩條有效抑制HepG2.2.15細胞中HBV基因表達和復(fù)制的siRNA;并且構(gòu)建了靶向HBV X區(qū)的lhRNA表達載體pMD-X1和pMD-X2;siRNA-1和siRNA-4可以抑制HepG2.2.15細胞培養(yǎng)上清液中HBsAg分泌,與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義,且可以抑制上清液中HBV DNA的復(fù)制,與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義;兩重建載體轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細胞,均能明顯抑制HepG2.2.