腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)運(yùn)的HDV核酶抑制HBV基因表達(dá)的初步研究.pdf

1、本課題組一直致力于研究反式作用HDV核酶對于乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）表達(dá)的工作，研究證實(shí)了HDV核酶作為HBV反義抑制劑的可行性，目前所需解決的是如何構(gòu)建高效、安全、且具有靶向性的轉(zhuǎn)移載體攜帶反式HDV核酶進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，更接近于臨床治療途徑。攜帶外源性治療基因的轉(zhuǎn)運(yùn)載體是基因治療的一個(gè)中心環(huán)節(jié)，決定著外源性治療基因是否能夠成功轉(zhuǎn)運(yùn)至靶細(xì)胞內(nèi)，也影響著外源性治療基因能否在細(xì)胞內(nèi)高效的表達(dá)。

2、 腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV）屬于微小病毒科，依賴病毒屬。AAV是一種可感染人類和一些其他靈長類動物的的小病毒。目前AAV不導(dǎo)致任何已知的疾病，因此這種病毒只引起非常輕微的免疫反應(yīng)。AAV即可感染分裂期細(xì)胞也可感染非分裂期細(xì)胞，并可將其基因組整合入宿主細(xì)胞基因組中位于人19號染色體的特異位點(diǎn)（AAVS1）中。制備AAV基因治療載體是需要剔除AAV基因組中的rep和cap區(qū)域，并將所需外源基因和能夠啟

3、動其轉(zhuǎn)錄的啟動子插入到兩端的反向重復(fù)序列（inverted terminal repeats，ITR）之間，有助于單鏈DNA的載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的DNA聚合酶作用下形成雙鏈DNA時(shí)在宿主細(xì)胞核內(nèi)形成多聯(lián)體結(jié)構(gòu)。腺相關(guān)病毒為基礎(chǔ)的基因治療載體在宿主細(xì)胞中主要以多聯(lián)體形式存在與宿主細(xì)胞核中。腺相關(guān)病毒還具有非常低的免疫原性，似乎僅限于新一代的中和抗體，但它們誘導(dǎo)沒有明確界定的細(xì)胞毒性反應(yīng)。這些特點(diǎn)使得AAV成為備受矚目的基因治療潛在病毒載體

4、。 HBV侵入肝細(xì)胞的機(jī)制是研究熱點(diǎn)之一。自發(fā)現(xiàn)HBV PreS2多肽與聚合白蛋白的結(jié)合活性只限于人和黑猩猩的聚合白蛋白而證實(shí)肝細(xì)胞存在白蛋白受體以來，便認(rèn)為HBV系借這種白蛋白受體同肝臟結(jié)合即侵入肝細(xì)胞。這種由HBV被膜抗原蛋白HBV DNA preS2所編碼的聚合人血清白蛋白的受體（polymerized human serum albumin receptor，pHSA-R），又稱HBV聚合白蛋白受體（HBVpAR）很可

5、能具有HBV種特異性與臟器特異性，因而在HBV侵入肝細(xì)胞機(jī)制中起有基因的表達(dá)；探討重組腺相關(guān)病毒的靶向性改造以及重組后腺相關(guān)病毒的包裝制備方法。 研究方法: 重組有HDV核酶的腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建：利用DNA重組技術(shù)將本課題組前期設(shè)計(jì)合成的反式作用HDV片段及其啟動子U6一同構(gòu)建入腺相關(guān)病毒載體pSNAV中，并在此載體中摻入EGFP熒光標(biāo)記蛋白基因。 2、重組有HDV核酶的腺相關(guān)病毒載體抑制HBV基因表達(dá)：用陽離

6、子脂質(zhì)體法將帶有綠色熒光蛋白標(biāo)簽的重組HDV核酶的腺相關(guān)病毒載體轉(zhuǎn)染入表達(dá)HBV的肝癌細(xì)胞HepG2．2．15中，用Elisa方法檢測其S抗原和E抗原的表達(dá)抑制作用。 3、重組有HDV核酶的腺相關(guān)病毒載體系統(tǒng)的構(gòu)建：利用DNA重組技術(shù)將反式作用HDV片段及其啟動子U6一同構(gòu)建入腺相關(guān)病毒載體pAAV-IRES-hrGFP中。將肝細(xì)胞靶向性序列preS2構(gòu)建入表達(dá)AAV殼體蛋白的控制質(zhì)粒pAAV-RC中，并將AAV殼體蛋白中的感染

7、相關(guān)R585、R588位點(diǎn)通過突變的方式封閉。 4、重組腺相關(guān)病毒的包裝：將構(gòu)建好的帶有HDV核酶的結(jié)構(gòu)質(zhì)粒和靶向性改造后的控制質(zhì)粒及輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞，反復(fù)凍融方法收獲重組腺相關(guān)病毒顆粒。然后感染肝癌細(xì)胞HepG2，檢測包裝效率。 研究結(jié)果： 1、經(jīng)酶切鑒定和PCR鑒定，構(gòu)建了分別含有針對HBV基因組C區(qū)和preS2區(qū)的反式作用HDV核酶的重組腺相關(guān)病毒載體pSNAV-CMV-EGFP-C-U6和p

8、SNAV-CMV-EGFP-preS2-U6。 2、利用陽離子脂質(zhì)體法將pSNAV-CMV-EGFP-C-U6和pSNAV-CMV-EGFP-preS2-U6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染表達(dá)HBV的HepG2．2．15細(xì)胞，并用Elisa方法檢測到其對HBV表達(dá)的抑制作用。pSNAV-CMV-EGFP-preS2-U6對HBeAg和HBsAg的抑制率約為29．53％和25％，pSNAV-CMV-EGFP-C-U6對HBeAg和HBsAg的抑制效果約

9、為63．5％和50．07％， 3、經(jīng)酶切鑒定和PCR鑒定，構(gòu)建了重組入反式作用HDV核酶的pAAV-IRES-hrGFP-U6-CRZ和pAAV-IRES-hrGFP-U6-S2RZ結(jié)構(gòu)質(zhì)粒和重組入肝細(xì)胞靶向序列 preS2和AAV殼體蛋白靶向相關(guān)序列突變的控制質(zhì)粒pAAV-RC-preS2-cap-A、pAAV-RC-cap-preS2-B、pAAV-RC-A585-588。 4、利用鈣磷沉淀法和陽離子脂質(zhì)體法將pAA

10、V-IRES-hrGFP-U6-CRZ和pAAV-IRES-hrGFP-U6-S2RZ結(jié)構(gòu)質(zhì)粒和pAAV-RC-preS2-cap-A、pAAV-RC-cap-preS2-B、pAAV-RC-A585-588控制質(zhì)粒及輔助質(zhì)粒pHelper共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T，收集包裝出的重組腺相關(guān)病毒顆粒。 5、經(jīng)倒置熒光顯微鏡觀察，重組的腺相關(guān)病毒顆粒可感染肝癌細(xì)胞，但其感染效率偏低。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了重組HDV核酶的