RNAi抑制牛朊病毒基因表達的相關(guān)試驗研究.pdf

1、牛海綿狀腦病俗稱瘋牛病，其主要癥狀是患牛精神狀態(tài)失常、共濟失調(diào)、感覺過敏和中樞神經(jīng)系統(tǒng)灰質(zhì)空泡化等。瘋牛病給世界的畜牧業(yè)以及人們的生活帶來極大危害，經(jīng)濟損失慘重。瘋牛病的病原是朊病毒(PrPsc),它是由機體正常的朊蛋白(PrPc)轉(zhuǎn)化而來，而PrPc是由朊蛋白基因（PRNP）編碼而來，有試驗證明PrPc的存在是朊病毒感染的基礎(chǔ)。一方面由于機體正常的朊蛋白是固定在細胞膜上的，提取純化較為困難，為了進一步在細胞水平上研究牛朊蛋白的生理生化

2、作用和朊蛋白疾病的發(fā)病機制，本實驗在體外構(gòu)建了表達PRNP基因的真核表達載體;另一方面由于RNAi能夠在細胞中高效特異的降解與其序列同源的mRNA，誘導(dǎo)特定靶基因的沉默，從而達到實現(xiàn)基因敲除或敲低的目的，因此，我們可以利用RNAi來敲低牛PrPc的量，從而使牛因缺乏轉(zhuǎn)化的底物而可能具有抵抗朊病毒病的能力。
　　 采用重疊延伸PCR法(SOE-PCR)全基因合成牛PRNP基因的cDNA，并克隆到真核表達載體pDsRED2-N1中，

3、得到牛PRNP基因真核表達載體，轉(zhuǎn)染牛骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)，并用800μg/mLG418對轉(zhuǎn)染的細胞進行藥物篩選。結(jié)果顯示通過SOE-PCR成功擴增了牛PRNP基因的cDNA，并構(gòu)建成真核表達載體，得到穩(wěn)定表達目的蛋白的BMSC細胞。
　　 利用RNAi技術(shù)，根據(jù)牛源PRNP基因cDNA設(shè)計3段siRNA序列和1個陰性對照序列，分別將其連接到RNA干擾載體pRNAT-U6.1/Neo上構(gòu)建成shRNA載體，并將shRNA

4、載體轉(zhuǎn)染牛骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC);通過Real-timePCR和Westernblotting篩選抑制效果最佳的載體，并用800μg/mLG418對轉(zhuǎn)染最佳載體的細胞進行藥物篩選。結(jié)果顯示成功構(gòu)建了3個靶向shRNA載體和1個陰性對照shRNA載體;3個靶向shRNA載體在不同時間段均在一定程度上下調(diào)了PRNPmRNA的表達，抑制了朊蛋白PrPc的生成，得到了一個最佳干擾載體sh3;通過藥物篩選出了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染sh3載體的細胞單克隆。