EB病毒相關腫瘤中病毒基因多態(tài)性研究.pdf

1、背景和目的：EB病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)與多種人類腫瘤的發(fā)生有關，如Burkitt's淋巴瘤(Burkitt's lymphoma，BL)、何杰金?。℉odgkin's disease，HD）、鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)以及胃癌等。EBV在人群中感染非常普遍，但EBV相關腫瘤的分布則具有明顯的地域性和人群傾向性，除環(huán)境因素和遺傳因素外，是否存在與EBV相關腫瘤有關的EB

2、V基因變異一直是倍受關注的熱點問題。以往對EBV基因多態(tài)性的研究多局限在NPC高發(fā)區(qū)，而且多針對單一基因，EBV基因變異與腫瘤發(fā)生的關系尚未獲得一致結論。本研究選擇我國NPC非高發(fā)區(qū)EBV陽性NPC、胃癌和健康人群作為研究對象，對多種基因的多態(tài)性進行檢測和分析，旨在探討EBV基因多態(tài)性在EBV陽性NPC和胃癌發(fā)生中的意義。通過比較同一人種NPC高發(fā)區(qū)和低發(fā)區(qū)EBV基因多態(tài)性，揭示EBV基因變異與EBV相關腫瘤發(fā)生的關系及EBV相關腫瘤地

3、域性分布的原因。
　　 方法：①采用原位雜交技術檢測175例NPC和1656例胃癌組織中EBV編碼小RNA1(EBV-encoded small RNA1，EBER1)、PCR-Southern雜交檢測268份健康成年人咽漱液(Throat washing，TW)標本中EBV BamHI-W片段以篩選EBV陽性標本。所有標本均采自山東省居住的當地漢族人群，籍貫山東，且上三代居住在山東省內。②PCR結合限制性片段長度多態(tài)性(res

4、triction fragment length polymorphism，RFLP)檢測分析EBV陽性標本中1/2分型、F/f分型和C/D分型。③PCR結合DNA測序檢測EBV陽性標本中EBV潛伏期基因EBER、核抗原1(EBV nuclear antigen 1，EBNA1)、潛伏膜蛋白1(latent membrane protein，LMP1)和BamHI-A區(qū)右向框0(BamHI-A rightward frame 0，BAR

5、FO)基因的多態(tài)性，應用DNAStar軟件對序列進行對比分析。與EBV標準株序列比較，根據各基因出現的共有突變，對各基因變異進行分類，進一步分析基因變異對相關基因功能的影響。④比較NPC、EBV相關胃癌(EBV-associated gastric carcinoma，EBVaGC)和健康人群各基因分型及各基因變異類型的分布，并與以往文獻發(fā)表的相關數據進行比較和分析。
　　 結果：
　　 ①分別從NPC、胃癌和TW標本中

6、檢出EBV陽性標本141例(80.6％，141/175)、101例(6.1％，101/1656)和108例(40.3％，108/268)。隨機取部分DNA質量高且樣本量充足的標本進行多態(tài)性檢測。
　　 ②1型、F型和C型EBV的檢出率分別為82.1％(215/262)、91.8％(236/257)和63.6％(147/247)，1/2分型和F/f分型在NPC、EBVaGC和健康人群之間的分布無顯著性差異；EBVaGC中D型EBV

7、的檢出率(52.4％，33/63)高于NPC(32.2％，39/121)和健康人群(28.6％，18/63)，差異有顯著性(EBVaGCvsNPC:P=0.010;EBVaGCvsTW:P=0.020)。
　　 ③EBER基因變異主要表現為點突變，154例標本可分為EB-6m、EB-8m和EB-10m等3種主要變異型。EB-6m檢出率最高，與以往2型毒株P3HR-1EBER序列一致；EB-8m和EB-10m為新發(fā)現的EBER變異

8、型，在NPC中的檢出率(27.7％，13/47)高于EBVaGC(2.0％，1/50)和TW(0％，0/55)，差異有顯著性（NPCvsEBVaGC:P=0.0002;NPCvsTW:P＜0.0001）；新變異型在EBER2轉錄區(qū)含有6個共有基因突變，其中4個（核苷酸44、46、57和61）位于其與細胞蛋白結合域。
　　 ④EBNA1根據其C端氨基酸487的變化及其它共有突變可分為5種亞型，本研究在137例標本共檢出V-val、

9、P-thrV、V-leuV和P-alaV等4種亞型，V-val檢出率最高，各亞型在3組人群中的分布無顯著性差異。1/2分型與EBNA1亞型有關聯(lián)性，2型EBV主要為P-thrV亞型，1型EBV主要為V-val亞型。
　　 ⑤LMP1根據其特征性的突變可以分為7種亞型，本研究130例標本共檢出China1、Med-和China2等3種主要亞型，China1檢出率最高。EBVaGC中China1亞型、XhoI(-)變異（N端XhoI

10、位點丟失）和del-LMP1（C端30bp缺失）的檢出率高于NPC和TW，差異有顯著性（P均＜0.01）；而且EBVaGC中China1亞型分離株氨基酸326E-→Q突變率為62.8％(27/43)，明顯高于NPC(17.2％，5/29)和TW(30.0％，9/30)，差異有顯著性(EBVaGCvsNPC:P=0.0002;EBVaGCvsTW:P=0.019)。1/2分型與LMP1亞型有關聯(lián)性，2型EBV主要為Med-亞型，1型EBV

11、主要為China1亞型。3種人群中1型分離毒株LMP1亞型的分布無顯著差異。
　　 ⑥BARFO基因在127例標本中均出現變異，1413bp范圍內有9處見于較多標本的錯義突變，與B95-8的核苷酸同源性均在99.2％以上。根據其氨基酸共有突變分為2組4種亞型，118例標本變異類似，歸為1組，另9例標本歸為另1組，3種人群中各亞型的分布無差異。除3例標本外，已報道的CTL表位序列(氨基酸356-364)和與Notch作用部位（氨基

12、酸351-371）在其余分離株均保守。
　　 ⑦與南方相關研究數據比較，山東地區(qū)3種人群均以1型EBV、EBNA1V-val亞型和LMP1China1亞型為主，與南方一致；山東地區(qū)D型EBV的檢出率高于南方；山東地區(qū)3種人群均以F型EBV為主，該變異在3種人群的分布類似，而南方NPC則以f變異為主，其它人群以F型EBV為主；山東地區(qū)NPC中可檢出3種EBNA1亞型(V-val、P-thrV和V-leuV)，且其分布與EBVaGC

13、和TW相同，而南方NPC中只檢出一種亞型(V-val)，與正常人群及非NPC病人檢出多種亞型的分布不同；山東地區(qū)LMP1China1亞型中較多標本出現氨基酸326E-→Q突變，而氨基酸335G→D突變率低于南方；山東地區(qū)LMP1檢出Med-亞型，未檢出B95-8亞型，而南方則存在B95-8亞型，Med亞型罕見。
　　 結論：①山東地區(qū)以1型、F型EBV為主，D型變異與EBVaGC相關。②EBER新變異型的發(fā)現提示EBER可以作為

14、研究EBV基因變異與腫瘤發(fā)生關系的靶基因，EBER新變異型可能與NPC的發(fā)生相關。③V-val是山東地區(qū)主要EBNA1亞型，其代表地域相關性變異。④China1是山東地區(qū)主要LMP1亞型，LMP1變異呈地域相關性，但也不排除伴有氨基酸326E→Q突變的China1亞型毒株與EBVaGC的相關性。⑤BARFO基因突變位點少，在不同人群中有類似的變異模式，提示其變異可能與腫瘤無相關性。⑥同一人種不同地域EBV基因多態(tài)性的差異與NPC的地域性