EB病毒相關胃癌病毒基因多態(tài)性的研究.pdf

1、目的：分析我國鼻咽癌(nasopharyngea.carcinoma，NPC)非高發(fā)區(qū)EB病毒相關胃癌（Epstein-Bar.Viru.associate.gastri.carcinoma，EBVaGC）組織中EBV分型及多種基因的多態(tài)性，確定是否存在與EBVaGC相關的EBV基因變異，深入探討我國EBV基因型在人群中的分布以及EBV在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。 方法：①收集山東地區(qū)362例新鮮胃癌組織及639例石蠟包埋胃癌組織，

2、應用PCR-Southern雜交檢測其特異性EB.DNA，進一步用原位雜交技術檢測PCR陽性標本石蠟切片組織中EBV編碼的小RNA(EB.encodin.smal.RNA，EBER)1的表達，以確證EBVaGC。以PCR-Southern雜交檢測260例健康人咽漱液(throa.washings，TWs)，篩選EBV阻性標本以做EB病毒相關胃癌病毒基因多態(tài)性研究的對照。②采用PCR-RFLP、巢式PCR及DNA測序等方法，檢測EBV陽性

3、標本病毒1/2分型、F/f分型、I/i分型及LMP.Xh.I(+)/(-)等4種基因變異，比較各組間EBV分型異同。③巢式PCR及DNA測序法對潛伏膜蛋白(laten.membran.protein.LMP1和LMP2A編碼基因，以及裂解期基因BARF1和BHRF1的多態(tài)性進行全面檢測，并參照B95-8標準株序列，應用DN.STAR軟件對所得序列進行比對分析，同時與已發(fā)表文獻中EBV基因多態(tài)性檢測結果比對分析，以尋找EBVaGC及健康T

4、Ws中上述病毒基因變異規(guī)律，探討是否存在與EBVaGC相關的EBV基因變異。結果：①1001例胃癌組織中有63例為EBVaGC(6.29％)，而健康TWs中EBV陽性率為23.08.(60/260)。②EBVaGCs和EBV陰性胃癌(EBV-negativ.gastri.carcinoma，EBVnGC)在年齡、發(fā)病部位及病理類型的差異有顯著性，EBVaGCs在<60歲人群的感染率高于≥60歲人群的感染率(X2=11.581，P=0.0

5、007)，胃底賁門和胃體發(fā)生率高于胃竇發(fā)生率（X2=4.684，P=0.030），且病理類型以低分化腺癌多見(X2=19.797，P=0.0005)。殘胃癌EBV感染率高達33.33％。此外，EBVaGCs和EBVnGC在性別和淋巴結轉移的差異均無顯著性。③EBVaGC中i型及Xh.I(-)型EBV的比率高于健康人，差異有顯著性；而1/2分型，F(xiàn)/f分型在EBVaGC和健康人群中的分布無差異。i/Xh.I(-)亞型在EBVaGC中的比率

6、(77.6％)高于健康人(52.6％)，差異有顯著性（X2=7.115，P=0.008）。④據LMP1特征性突變分型，23例EBVaGC病毒株中，有22例出現(xiàn)Chinal型EBV特征性點突變，其中19株為Chinal型EBV。29例TWs株中，則有18例為Chinal型，該型EBV在兩組間的差別無統(tǒng)計學意義。另外，TWs中尚有6例為Med-型，1例為China2型，1例為NC型，其余3例標本則具有不同型別的突變特點。分別有19例EBVa

7、GC及22例TWs呈30b.(168294nt-168265nt，AA343-352)缺失，兩者之間30bp缺失率差異無統(tǒng)計學意義。21株EBVaGC發(fā)生AA32.E→Q突變，而TWs中僅有7株，EBVaGC此位點突變率遠高于健康對照。⑤與EB.B95-8毒株比較發(fā)現(xiàn)，EBVaGC及健康對照TWs標本LMP2A基因共出現(xiàn)30處錯義突變，并導致9處CTL表位變異，其中4處表位的變異情況為首次報道；4處突變?yōu)樗袠吮竟灿小Ｍ怙@子1與外顯子2

8、-8變異不同步：外顯子1各變異類型在EBVaGC及健康對照中分布頻率無顯著性差異；而外顯子2-8中主要變異類型Groupl出現(xiàn)頻率在EBVaGC和TWs中的分布有顯著性差異；氨基末端主要功能區(qū)在所有標本中均嚴格保守。⑥除BHRF1基因編碼區(qū)內1處突變（AA8.L→V）在多株標本出現(xiàn)外，各標本病毒裂解期基因BARF1及BHRF1未發(fā)現(xiàn)一致序列變異，僅有的少數(shù)變異呈散在分布。與B95-8標準株序列相比，各標本BARF1序列同源性均≥98.9

9、％，而BHRF1同源性均≥99.1％。EBVaGC及健康人群TWs標本間兩基因均無明顯差異。BHRF1基因變異多分布于現(xiàn)已確認的bcl-2同源結構域外。 結果：①EBV感染與部分胃癌的發(fā)生有關，且EBVaGC具有獨特臨床病理特征。②本研究初步證實i/Xh.I(-)型EBV是與山東地區(qū)EBVaGC相關的變異型。③首次證實以LMPI基因變異分類的Chinal型為山東地區(qū)EBVaGC和健康人群中的優(yōu)勢病毒亞型。AA32.E→Q突變可能

10、與胃癌發(fā)生相關。④首次對EB.LMP2A全編碼基因進行綜合分析，將外顯子1與外顯子2-8的序列多態(tài)性分型，并探討各變異類型與地域或疾病間的關系。研究表明山東地區(qū)EBVLMP2A基因外顯子1各變異類型呈地域相關性；證實4處中國EBV共有的特異突變；而外顯子2-8主要變異類型Groupl可能與EBVaGC有一定相關性。⑤裂解期基因BARF1及BHRF1序列在EBVaGC及TWs中均高度保守，提示它們在維持病毒基本生物學活性上具有關鍵作用，兩