花生AhFAD2基因的RNAi抑制表達遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、花生(Arachis hypogaea L.)起源于南美洲,是世界第四大含油種子作物.花生油主要由棕櫚酸,油酸和亞油酸組成.油類中多不飽和脂肪酸的含量、組成和生理狀態(tài)是油類品質(zhì)最重要的決定因素.植物油富含油酸,是比富含多不飽和脂肪酸的油類更優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品.高油酸、低多不飽和脂肪酸的油類便于貯藏,對人體健康大有益處,是商業(yè)和營養(yǎng)上所需要的.△<'12>-油酸脫氫酶(△<'12>-oleicacid desaturase,FAD2)向脂肪酸碳鏈

2、上引入第二個雙鍵,是促進油酸轉(zhuǎn)化為亞油酸的關鍵酶.FAD2基因開放讀碼框(ORF)為1140bp,編碼379個氨基酸,它包含一個內(nèi)含子,位于編碼區(qū)3'末端.花生中存在兩個FAD2同源基因(AhFAD2A.AhFAD2B),它們可能是來自原始二倍體起源種的同源基因.ahFAD2A的突變和ahFAD2B轉(zhuǎn)錄物水平的大量降低共同造成了花生品種中的高油酸表型,并且一個編碼功能性酶的表達基因似乎對正常油酸表型是足夠的.FAD2基因的表達水平還受溫

3、度影響.總之,FAD2A、FAD2B這兩個同功酶基因是控制油酸含量的關鍵酶基因,但可能其他酶基因或多種調(diào)控機制也起著重要作用.FAD2在微生物工程、油料作物基因工程和植物油質(zhì)改造等方面成為科學研究的熱點之一. 本試驗將倒位重復的△12脂肪酸脫氫酶基因AhFAD2片段與經(jīng)改造的含CaMV35S啟動子的表達載體pCAMBIAl302相連,構建了載體pCSF;將倒位重復的AhFAD2基因與種子特異性表達的大豆凝集素啟動子相連連接到表達

4、載體pCAMBIAl300中,構建了載體pCLF,將兩個載體導入農(nóng)桿菌LBA4404和EHAl05,以山東主產(chǎn)大花生魯花14號和豐花1號成熟種子的上胚軸和子葉為受體材料進行遺傳轉(zhuǎn)化,實現(xiàn)該倒位重復基因片段對花生中AhFAD2基因表達的抑制.由于在雙子葉植物,特別是花生中,使用潮霉素做篩選劑的少有報道,且不同品種花生、花生不同部位對潮霉素濃度的敏感度差異較大,因此在進行花生的遺傳轉(zhuǎn)化之前,我們設計了一組梯度篩選試驗.最終確定花生胚軸轉(zhuǎn)化體

5、系的篩選濃度為潮霉素25mg/L,子葉轉(zhuǎn)化體系的篩選濃度為潮霉素10mg/L,即為篩選劑的基礎壓力.此外,不同農(nóng)桿菌菌株對不同植物的轉(zhuǎn)化效率差異很大.曾有報道指出農(nóng)桿菌LBA4404和EHA105對花生具有較高的轉(zhuǎn)化效率,為確定哪種對花生轉(zhuǎn)化效率更高,我們選取了這兩種菌株進行對照實驗.結果顯示與LBA4404 42.01﹪的轉(zhuǎn)化率相比,EHA105對花生具有更高的轉(zhuǎn)化率,可達48.74﹪.經(jīng)潮霉素選擇培養(yǎng)基篩選培養(yǎng),獲得了轉(zhuǎn)化植株400

6、余株,其中CaMv35S啟動子啟動的180余株,種子特異性表達的大豆凝集素啟動子啟動的230余株.我們對轉(zhuǎn)化苗進行了分子生物學的驗證,PCR結果顯示,CaMV35S啟動子調(diào)控表達的植株和種子特異性表達的大豆凝集素啟動子調(diào)控表達的植株均有大部分擴增出372bp的特異性目的條帶,表明△<'12>脂肪酸脫氫酶基因 AhFAD2的RNAi抑制表達框架已整合進花生中.PCR Southern結果表明,野生型植株(對照)沒有明顯的雜交信號,轉(zhuǎn)基因株

7、系有強陽性信號. 作為對照,我們同時培養(yǎng)了未經(jīng)轉(zhuǎn)化的再生苗.與再生植株相比經(jīng)篩選獲得的轉(zhuǎn)化苗部分植株表現(xiàn)畸形,出現(xiàn)葉片皺縮濃綠,基部膨大,果枝間距縮短,不能正常生根等現(xiàn)象,其余雖形態(tài)正常但大都生長緩慢,莖稈弱小,嘗試了多種方法進行改進,但效果不太理想.脂肪酸代謝是生物體基本生命活動之一,脂肪酸是膜脂結構的重要組成部分,這些現(xiàn)象也許是由于抑制了△<'12>脂肪酸脫氫酶基因所引起的,但是也有報道指出潮霉素對組培植株的生長發(fā)育具有很多