花生ahFAD2B基因反義表達(dá)載體構(gòu)建與基因轉(zhuǎn)化影響因素的研究.pdf

1、1．△<'12>脂肪酸脫氫酶的克隆與反義表達(dá)載體的構(gòu)建花生脂肪酸組分中含量最高的是油酸和亞油酸，油酸/亞油酸(O/L)比率是影響花生耐貯藏性的主要指標(biāo)?！?'12>脂肪酸脫氫酶是催化油酸轉(zhuǎn)變?yōu)閬営退岬年P(guān)鍵酶。本研究根據(jù)Genbank上發(fā)表的△<'12>脂肪酸脫氫酶基因(ahFAD2B)的序列設(shè)計(jì)引物，以花生2005D029(國槐DNA導(dǎo)入79266后選育的品系)幼嫩葉片為材料，提取基因組DNA，以此為模板經(jīng)多聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增

2、，回收PCR產(chǎn)物與克隆載體pGM-Teasy連接，獲得重組質(zhì)粒pFAD2B，序列分析表明，PCR產(chǎn)物為約1200bp的DNA片斷，與Genbank發(fā)表的ahFAD2B序列AF248739的同源性為97％。重組子pFAD2B和質(zhì)粒pBI121分別用BamH I和Sac I雙酶切，并回收目的基因片斷和切除GUS基因的pBIl21載體DNA，經(jīng)連接構(gòu)建成abEAD2B基因的反義表達(dá)載體。 2．影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)花生基因轉(zhuǎn)化因素的研究以花生

3、胚小葉為外植體，用攜帶有γ-維生素E甲基轉(zhuǎn)移酶基因(γ-tmt)和篩選標(biāo)記基因bar 植物表達(dá)載體(質(zhì)粒為pGBVE，根癌農(nóng)桿菌為GV3101)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，設(shè)置了在農(nóng)桿菌侵染時(shí)添加不同濃度煙草葉片提取液、超聲波處理及在農(nóng)桿菌菌液活化和共培養(yǎng)階段添加不同濃度乙酰丁香酮(AS)等試驗(yàn)，研究了對花生基因轉(zhuǎn)化的影響。主要結(jié)果如下： (1)適直時(shí)間的超聲波處理可有效提高花生基因轉(zhuǎn)化率外植體在菌液中侵染時(shí)間均為15min，同時(shí)將盛有外植體

4、和菌液的三角瓶置于超聲波清洗器中央進(jìn)行不同時(shí)間長度的處理，分別為0、2、4、6、8、10、15min 7種處理時(shí)間長度。以最終獲得的抗性苗數(shù)比處理的外植體數(shù)計(jì)算轉(zhuǎn)化率。7個(gè)處理的轉(zhuǎn)化率分別為0.79％、0.72％、1.12％、1.30％、0.42％、0、0。超聲波處理適宜的時(shí)間長度則可提高轉(zhuǎn)化率，以處理6min效果最明顯，轉(zhuǎn)化率比對照高65％，處理8min以上則轉(zhuǎn)化率降低，處理10min以上轉(zhuǎn)化率為0。另外，超聲波處理均不同程度的影響分

5、化出苗，處理10min以上嚴(yán)重影響分化出苗，處理15min則不能分化出苗。 (2)添加適量煙草提取液可有效提高花生基因轉(zhuǎn)化率農(nóng)桿菌侵染時(shí)菌液中加入煙草提取液，濃度設(shè)置0、37.5、75、112.5、1.50mg/ml(煙草幼葉鮮重/菌液體積)5個(gè)水平，以最終獲得的抗性苗數(shù)比處理的外植體數(shù)計(jì)算轉(zhuǎn)化率。結(jié)果表明，煙草提取液濃度為112.5mg/ml時(shí)，轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到1.58％，是對照的2.26倍。低濃度的37.5、75mg/ml處

6、理，轉(zhuǎn)化率亦顯著高于對照，而150mg/ml濃度則轉(zhuǎn)化率低于對照。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，煙草提取液能促進(jìn)芽叢的分化和農(nóng)桿菌的繁殖。 (3)添加AS不能提高花生的基因轉(zhuǎn)化率在活化農(nóng)桿菌或共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中加入AS，培養(yǎng)基中AS濃度均設(shè)置為0、50、100、150、200μmol/L5個(gè)水平。結(jié)果表明，無論在活化農(nóng)桿菌時(shí)還是共培養(yǎng)時(shí)加入AS，50和100μmol/L兩種濃度對提高花生基因轉(zhuǎn)化率的作用不明顯，而150和200μmol/L時(shí)，基因