花生種子特異表達(dá)載體構(gòu)建與農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化技術(shù)體系的優(yōu)化.pdf

1、花生是世界范圍內(nèi)廣泛栽培的油料與經(jīng)濟(jì)作物,是全球四大油料作物之一,也是我國單產(chǎn)、總產(chǎn)和出口創(chuàng)匯額最高的油料作物。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良花生籽仁品質(zhì)是花生分子育種研究的重要領(lǐng)域。本研究采用同源克隆技術(shù)從花生栽培品種豐花3號(hào)基因組中分離獲得了兩個(gè)種子特異表達(dá)啟動(dòng)子,并構(gòu)建成了種子特異表達(dá)載體；研究了基因型、芽叢誘導(dǎo)培養(yǎng)基和芽叢成苗培養(yǎng)基三個(gè)因素對(duì)花生胚小葉再生效率的影響,獲得了三因素最優(yōu)組合的花生胚小葉離體再生體系；并對(duì)21個(gè)基因型花生進(jìn)行了基

2、因轉(zhuǎn)化效率的比較研究,獲得了轉(zhuǎn)基因植株,PCR檢測證明目的基因已整合到花生基因組中。為花生品質(zhì)改良的分子育種研究奠定了基礎(chǔ)。其主要結(jié)果如下： 1. 花生油體蛋白Oleosin基因啟動(dòng)子的克隆及其種子特異表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)GeneBank上發(fā)表的花生Oleosin17.8基因的序列(EF695400)設(shè)計(jì)引物,用豐花3號(hào)基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增花生Oleosin啟動(dòng)子,瓊脂糖凝膠電泳回收PCR擴(kuò)增的目的片段,并與克隆載體p

3、GM-Teasy連接,獲得重組質(zhì)粒pT-OL1584,序列分析表明,獲得的啟動(dòng)子序列長1584bp,與GenBank發(fā)表的Oleosin17.8啟動(dòng)子同源性為99.37％,除含有TATA、CAAT基本轉(zhuǎn)錄元件外,還有2個(gè)富含AT序列、2個(gè)RY重復(fù)序列元件、1個(gè)ACCCCA元件,2個(gè)TACACAT盒、5個(gè)CATG盒、5個(gè)E-Box、6個(gè)GATA-Box及14個(gè)DOF蛋白的AAAG基序等種子特異型啟動(dòng)子所具有的順式作用元件。OL1584的G

4、eneBank登錄序列號(hào)為EU518466。重組子pT-OL1584用HindⅢ、BamH Ⅰ雙酶切,并回收目的OL1584基因片斷和切除35S啟動(dòng)子的pBI121載體DNA,經(jīng)連接構(gòu)建成種子特異表達(dá)載體pB-OL1584。并且在OL1584內(nèi)部設(shè)計(jì)2個(gè)上游引物以重組質(zhì)粒pT-OL1584為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得含Oleosin啟動(dòng)子5’端缺失片段的重組子pT-OL755和pT-OL375。 2.花生致敏蛋白基因Ara h1

5、啟動(dòng)子的克隆及其種子特異表達(dá)載體的構(gòu)建參考王靜(2005)和Olga M(2003)報(bào)道的花生Ara h1基因的序列設(shè)計(jì)引物,用豐花3號(hào)基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增花生Ara h1啟動(dòng)子,1.2％瓊脂糖凝膠電泳回收PCR擴(kuò)增的目的片段,并與克隆載體pGM-T easy連接,獲得重組質(zhì)粒pT-Ah1968,序列分析表明,Ah1968(GeneBank登錄號(hào)為EU526898)啟動(dòng)子序列長1968bp,與王靜發(fā)表的序列同源性為99.14

6、％,與Olga M發(fā)表的序列同源性為98.27％.Ah1968除含有基本轉(zhuǎn)錄元件TATA、CAAT外,還含有3個(gè)AT-Rich、2個(gè)RY元件、3個(gè)CATG、1個(gè)ACCCCA、2個(gè)E-Box、2個(gè)TACACAT類似序列、2個(gè)TAACACA、10個(gè)GATA-Box和13個(gè)AAAG(DOF蛋白結(jié)合基序)等種子特異型啟動(dòng)子所具有的順式作用元件。重組子pT-Ah1968和質(zhì)粒pBI121分別用HindⅢ、BamH I雙酶切,并回收目的基因片斷(約

7、1716bp)和切除35S啟動(dòng)子的pBI121載體DNA,經(jīng)連接構(gòu)建成種子特異表達(dá)載體pB-Ah1716。在Ah1968內(nèi)部設(shè)計(jì)3個(gè)上游引物以重組質(zhì)粒pT-Ah1968為模板,進(jìn)行PER擴(kuò)增,獲得了Ara h1啟動(dòng)子5’端缺失片段的重組子pT-Ah1300、pT-Ah1000和pT-Ah500。 3. 花生胚小葉離體再生技術(shù)體系的優(yōu)化(1) 不同品種適宜芽叢誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選小花生品種豐花2號(hào)適宜的芽叢誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MSB+3.0m

8、g/L BA+0.7mg/L NAA,芽叢誘導(dǎo)率為81.49％,再生率為94.39％；大花生品種豐花3號(hào)適宜的芽叢誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MSB+4.5mg/L BA+0.2mg/L NAA,芽叢誘導(dǎo)率為72.33％,再生率為10.70％。 (2) 不同品種適宜芽叢成苗培養(yǎng)基的篩選豐花2號(hào)適宜的芽叢成苗培養(yǎng)基為MSB+2.5mg/L BA,芽叢出苗率、再生率分別為：172.00％和122.10％；豐花3號(hào)適宜的芽叢成苗培養(yǎng)基為MSB+5.0mg/L

9、 KIN,芽叢出苗率、再生率分別為：33.33％、4.03％。 不同基因型之間的成苗芽叢百分率、芽叢出苗率和植株再生率差異顯著,基因型不同是造成花生再生率差異的主要因素。以胚小葉為外植體獲取較高植株再生率的三因素最佳組合為：花生品種豐花2號(hào)、芽叢誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MSB+3.0mg/L BA+0.7mg/L NAA,芽叢成苗培養(yǎng)基為MSB+2.5mg/L BA?？勺鳛榛ㄉ蜣D(zhuǎn)化良好的受體系統(tǒng)。 4. 不同基因型花生基因轉(zhuǎn)化效

10、率的比較以花生胚小葉為外植體,用攜帶有γ-維生素E甲基轉(zhuǎn)移酶基因(γ-tmt)和篩選標(biāo)記基因bar的植物表達(dá)載體(質(zhì)粒為pGBVE,根癌農(nóng)桿菌為GV3101),對(duì)花生21個(gè)基因型進(jìn)行了基因轉(zhuǎn)化。結(jié)果表明：農(nóng)桿菌侵染后再生率較高的10個(gè)基因型為：豐花2號(hào)、02P181、豐花3號(hào)、不結(jié)瘤系、豐花1號(hào)、白沙1016、豐花6號(hào)、05D651、海花1號(hào)、蓬萊-窩猴；基因轉(zhuǎn)化率較高的5個(gè)基因型為：豐花2號(hào)、豐花1號(hào)、豐花3號(hào)、白沙1016、02P1