農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜遺傳轉(zhuǎn)化及花粉特異表達細胞周期基因分析.pdf

1、油菜（Brassica napus）是世界上四大油料作物之一。它不僅是食用植物油的最主要來源，也是僅次于豆粕的大宗飼用蛋白源，而且還是用于解決能源危機方向之一的生物柴油的理想原料。近年來，基因工程的手段被廣泛用于改良油菜的產(chǎn)量、品質(zhì)及抗逆性，以滿足人們對食用油和能源需求的日益增長。因此，進一步改進現(xiàn)有遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，提高油菜轉(zhuǎn)化效率很有意義。細胞周期基因是一類對植物生長發(fā)育有重要影響的功能基因，研究它對花粉發(fā)育的影響，可充實研究領(lǐng)域在這方

2、面的信息。擬南芥（Arabidopsis thaliana）作為一種重要的模式植物，與油菜基因組有著高度的同源性，在基礎(chǔ)研究中廣泛應(yīng)用。
　　 本實驗以甘藍型春油菜作為主要材料，進行了一系列遺傳轉(zhuǎn)化實驗，對現(xiàn)行轉(zhuǎn)化程序從操作環(huán)節(jié)上做了一些有意義的改良。同時，將GUS報導(dǎo)基因與花粉特異啟動子NTM19連接轉(zhuǎn)入油菜，研究了在花粉特異啟動子作用下，GUS基因表達的時空特異性；將周期蛋白基因與花粉特異啟動子NTM19連接轉(zhuǎn)入油菜，研究了

3、周期周期蛋白基因?qū)ǚ郯l(fā)育的影響。
　　 1．油菜遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)改良
　　 在油菜轉(zhuǎn)化實驗中，獲取受侵染外植體時，將常規(guī)的垂直切取下胚軸的方法改為45°斜角切取法，提高了轉(zhuǎn)化效率達3-4個百分點。在制備農(nóng)桿菌時，用LB和AB培養(yǎng)基活化農(nóng)桿菌，分別探討農(nóng)桿菌最佳轉(zhuǎn)染濃度：LB中，農(nóng)桿菌OD值為0.6-0.8；AB中，農(nóng)桿菌OD值為0.2-0.3。
　　 2．花粉特異啟動子功能驗證
　　 對花粉特異啟動子NTM

4、19的作用時期觀察發(fā)現(xiàn)，報道基因GUS表達的最早時期是花粉減數(shù)分裂四分體形成時期；其表達部位也主要集中在細胞核區(qū)域，在早期花粉細胞，如單核早期細胞中表達尤為明顯。
　　 3．細胞周期基因功能驗證
　　 對轉(zhuǎn)NTM19：CycD2基因、NTM19：CycD3基因、35S：CycD3基因油菜花粉細胞和陰性對照細胞發(fā)育過程和形態(tài)進行一系列觀察。發(fā)現(xiàn)周期蛋白基因CycD2和CycD3在花粉特異啟動子NTM19的控控制下過量的過量

5、表達，使花粉細胞產(chǎn)生了由三溝細胞向四溝細胞、五溝細胞、六溝細胞的變異。
　　 4．外源基因在轉(zhuǎn)化植株中的表達分析
　　 通過RT-PCR分子檢測轉(zhuǎn)基因植株，發(fā)現(xiàn)CycD2的cDNA在油菜中表達時比正?；蚱味嗔艘粭l相對縮短的片段，表現(xiàn)為剪切模式錯誤。當(dāng)用從擬南芥組DNA中克隆得到的CycD2基因做同樣的轉(zhuǎn)化及檢測實驗時，發(fā)現(xiàn)CycD2基因在擬南芥里表達正常。轉(zhuǎn)NTM19：CycD3（cDNA）基因油菜和擬南芥中，外源基