水稻花粉及精細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室從水稻精細(xì)胞中克隆得到了3個(gè)在精細(xì)胞中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的基因：PS66、RSSG58和RSSG8，并對(duì)他們開展了很多研究。本論文進(jìn)一步展開對(duì)RSG6基因的研究工作，在遺傳轉(zhuǎn)化方面進(jìn)行試驗(yàn)，為揭示其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。另外，分離得到了水稻單核、二核與三核花粉，提取RNA用于基因芯片研究。以下為本論文主要研究內(nèi)容： 1．以水稻中花11號(hào)成熟胚為材料，誘導(dǎo)愈傷組織分化成苗，建立了一個(gè)較高效。率的水稻愈傷組織再生系統(tǒng)，愈傷組織出苗率為8

2、9.6％，明顯高于已報(bào)道的愈傷組織出苗率為81.7％的結(jié)果。同時(shí)對(duì)愈傷組織與再生苗的(G-418耐受性做了試驗(yàn)，50mg/L的G-418即可抑制愈傷組織與小苗的生長，可使用此濃度篩選轉(zhuǎn)基因植株。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將包含有RSG6反義基因的pBin19-ran質(zhì)粒轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織中，誘導(dǎo)分化，得到了抗性小苗。 2．以水稻花穗為原材料，采用過濾結(jié)合蔗糖密度梯度離心的方法，分離得到純 度較高的單核、二核和三核花粉。所得單核、二核及三核花

3、粉純度分別為 95.2％、90.3％和97.60／，高活力花粉的所占的比率依次為60.3％、86.7％和 92.3％。分離到的花粉用Rneasy Plant Mini Kit提取得到了高質(zhì)量的RNA，已用于基因芯片分析水稻花粉優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因；分離得的花粉還可以繼續(xù)培養(yǎng)，作為細(xì)胞生物學(xué)研究的材料，來對(duì)水稻花粉進(jìn)行研究。 3．本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)對(duì)水稻精細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因RSG6開展了很多研究。為了進(jìn)一步了解RSG6在體外的表達(dá)情況，將其閱

4、讀框連入雙元載體pB121中，由35s啟動(dòng)子調(diào)控基因。用農(nóng)桿菌浸染法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入擬南芥中?？敲顾睾Y選抗性植株，得到抗性植株并培養(yǎng)收耿第二代種子，以用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。為了解RSG6的整合和表達(dá)情況和推測(cè)RSG6基因的功能奠定了基礎(chǔ)。 將mGFP4閱讀框與RSG6閱讀框一起連入載體pBl221中，構(gòu)建融合蛋白瞬時(shí)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增。大量提取此重組質(zhì)粒后，用PEG介導(dǎo)法將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入擬南芥原生質(zhì)體中。試圖通過熒光蛋白的指示