高賴氨酸蛋白基因?qū)λ镜倪z傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、水稻是主要的糧食作物，世界上約有1/2的人口以稻米為主食。但是在稻米、玉米等禾本科植物的儲(chǔ)藏蛋白中，賴氨酸含量偏低，是第一限制性氨基酸，嚴(yán)重影響其它氨基酸的吸收利用。提高稻米賴氨酸的含量，能在很大程度上提高稻米蛋白質(zhì)的利用率。因此如何提高稻米的賴氨酸含量成了人們關(guān)注的問題。
　　 傳統(tǒng)的育種方法雖然在一定程度上提高了賴氨酸含量，但是提高潛力不大，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。基因工程技術(shù)的發(fā)展為改良水稻種子蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)提供了有效的手段，并取得一定

2、的研究進(jìn)展。但是隨著轉(zhuǎn)基因植物的商品化生產(chǎn)，其安全性問題也日益引起人們的極大關(guān)注。選擇標(biāo)記基因的使用是安全性問題的主要來源。
　　 本研究擬將具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的大豆高賴氨酸蛋白基因，賴氨酸重量比分別為18.22％和19.93％的GsHLP2和GsHLP8轉(zhuǎn)入水稻，對(duì)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平和賴氨酸含量分析，獲得轉(zhuǎn)高賴氨酸蛋白基因的水稻，為培育高賴氨酸轉(zhuǎn)基因水稻新品種提供材料。同時(shí)，本研究應(yīng)用雙T-DNA載體，利用其后代重組分離性質(zhì)

3、，可培育出無選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因水稻，徹底解決篩選標(biāo)記基因及其產(chǎn)物可能導(dǎo)致的轉(zhuǎn)基因安全性問題，試圖為培育高營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)且生物安全的轉(zhuǎn)基因作物研究提供一條新的途徑。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1.克隆了水稻種子特異型啟動(dòng)子GluB-4利用RT-PCR方法從水稻中克隆種子特異型啟動(dòng)子GluB-4，序列分析表明，GluB-4基因序列與GenBank上公布的序列一致。
　　 2.構(gòu)建了分別含高賴氨酸蛋白基因GsHLP2

4、和GsHLP8的雙T-DNA表達(dá)載體共8個(gè)構(gòu)建分別由Ubi組成型啟動(dòng)子和GluB-4水稻種子特異型啟動(dòng)子調(diào)控的、分別帶有和不帶有增強(qiáng)子P2的、選擇標(biāo)記基因?yàn)锽ar基因的GsHLP2基因及GsHLP8基因的雙T-DNA植物表達(dá)載體8個(gè)，并將其導(dǎo)入到農(nóng)桿菌LBA4404，以用于下一步轉(zhuǎn)化水稻。
　　 3.獲得了轉(zhuǎn)高賴氨酸蛋白基因GsHLP8的水稻PCR陽性植株利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)水稻“五優(yōu)稻1號(hào)”進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)pTTBUP2G8

5、抗性植株10株，轉(zhuǎn)pTTBGG8抗性植株20株，轉(zhuǎn)pTTBGP2G8抗性植株12株，PCR陽性植株分別為4株、14株、7株。
　　 4.檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因水稻植株中高賴氨酸基因GsHLP8的轉(zhuǎn)錄水平對(duì)T0代轉(zhuǎn)pTTBUP2G8質(zhì)粒PCR陽性植株進(jìn)行了Real-timePCR檢測(cè)，結(jié)果表明，GsHLP8基因超量表達(dá)。
　　 5.轉(zhuǎn)基因水稻植株的賴氨酸含量測(cè)定對(duì)Real-TimePCR檢測(cè)超量表達(dá)的株系采用茚三酮顯色法進(jìn)行賴氨酸含