水稻線粒體熱激蛋白70基因和擬南芥lpa1，lpa2基因的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、水稻是重要的糧食作物，同時也是重要的單子葉模式生物。前期研究表明，水稻線粒體熱激蛋白70（mtHSP70）在鹽脅迫誘導(dǎo)的根尖細胞程序性死亡過程中可能發(fā)揮重要作用，本文開展了mtHSP70轉(zhuǎn)基因水稻的創(chuàng)建，以便進一步研究線粒體HSP70在植物細胞程序性死亡中發(fā)揮的功能。與植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中常見的核轉(zhuǎn)化相比，葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化具有生物安全性好，表達量高，可直接表達原核基因等優(yōu)點。LPA1和LPA2（低PSⅡ累積）在光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）的穩(wěn)定性方面發(fā)

2、揮重要作用，本文同時開展了擬南芥lpa1和lpa2基因轉(zhuǎn)化煙草葉綠體的研究。具體內(nèi)容如下：
　　 從水稻cDNA中擴增線粒體hsp70基因，正向、反向插入載體pCAMBIA1304中，構(gòu)建表達載體p1304-hsp（+）、p1304-hsp（-）。利用農(nóng)桿菌侵染水稻愈傷組織，通過潮霉素篩選，獲得抗性愈傷組織。將一部分抗性愈傷轉(zhuǎn)移至選擇分化培養(yǎng)基，分化再生為轉(zhuǎn)基因植株。將另一部分抗性愈傷組織在液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)成懸浮細胞系，并對

3、懸浮細胞進行保存，為進一步在細胞水平研究hsp70功能奠定基礎(chǔ)。對載體和目的基因部分片段PCR擴增證明正向、反向載體已成功轉(zhuǎn)化進水稻。半定量RT-PCR證明在轉(zhuǎn)錄水平上，正向轉(zhuǎn)化產(chǎn)物hsp70基因獲得過量表達，反向轉(zhuǎn)化產(chǎn)物hsp70基因表達受到抑制。
　　 為了構(gòu)建葉綠體表達載體，從質(zhì)粒pCN1中擴增壯觀霉素抗性基因aadA，從煙草葉綠體基因組中擴增Prrn和TrbcL作為 aadA的啟動子和終止子。從擬南芥中擴增目的基因lpa

4、1和lpa2，從煙草葉綠體基因組中擴增PpsbA和TpsbA作為目的基因的啟動子和終止子。從煙草基因組中擴增Ty序列連接到pUC19中，酶切Ty序列作為左右同源序列。將aadA表達盒和lpa1/lpa2表達盒克隆到左右同源序列中間，得到煙草葉綠體表達載體pU-a1/pU-a2。同時對煙草進行組織培養(yǎng)，將無菌苗葉片誘導(dǎo)愈傷組織并再生成植株，證明組織培養(yǎng)體系的可行性。利用基因槍對煙草進行葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化，轟擊參數(shù)：金粉含量為500μg/槍，D