HBV前S2蛋白對信號分子LPA的影響及LPA對胰島素分泌的作用.pdf

1、目的：研究HBV pre-S2的表達與細胞核內定位，pre-S2對水解性溶血磷脂酸(LPA)的溶血磷脂酶A1（LYPLA-1）啟動子的反式激活作用，以及外源性LPA對胰島素分泌的影響，為進一步研究乙型肝炎并發(fā)糖尿病的發(fā)病機制提供研究線索與實驗依據(jù)。
　　方法：⑴HBVpre-S2的表達與細胞核內定位(1)HBV pre-S2和綠色熒光蛋白融合基因表達載體的構建:從乙肝患者血清中提取HBV DNA，設計帶HindⅢ、EcoRⅠ酶切位

2、點的特異性引物擴增HBVpre-S2基因，膠回收后克隆入T-easy載體構建pGEM-HBV-S2。HindⅢ、EcoRⅠ雙酶切pGEM-HBV-S2和pcDNA3.1-EGFP，分別膠回收pre-S2基因片段及酶切后的pcDNA3.1(+)-EGFP質粒，連接后轉化大腸桿菌DH5α以獲得pcDNA3.1-PreS2-EGFP。⑵pre-S2在細胞核內的表達:pcDNA3.1-PreS2-EGFP轉染HepG2細胞48h后，經4'，6-

3、二脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色細胞核，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達。2.pre-S2對LYPLA-1啟動子的反式激活作用應用LYPLA-1啟動子熒光素酶報告基因質粒pGL3-LYPLA-1和pre-S2真核表達質粒pcDNA3.1(-)-pre-S2共轉染HepG2，然后通過檢測細胞熒光素酶活性來評價pre-S2對LYPLA-1基因啟動子的作用。⑶外源性LPA對胰島

4、素分泌的影響：小鼠胰島細胞的分離純化:首先通過膽總管逆行灌注膠原酶Ⅴ溶液進行小鼠胰腺消化，分離胰島，然后采用不連續(xù)密度梯度Ficoll離心法純化胰島細胞；外源性LPA對胰島細胞胰島素分泌的影響:以0μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L和5μmol/L濃度LPA刺激原代培養(yǎng)的胰島細胞和分泌胰島素細胞MIN6，以培養(yǎng)液總蛋白濃度校正胰島素分泌量測定胰島素濃度。
　　結果：重組載體pcDNA3.1

5、-PreS2-EGFP測序結果證實其包含HBVpre-S2基因序列，經亞克隆后酶切及測序均證實構建的重組載體與設計一致。熒光顯微鏡觀察結果顯示，pEGFP-preS2轉染后可介導pre-S2-EGFP融合蛋白表達且綠色熒光明顯集中在細胞核內。HBV pre-S2激活LYPLA-1基因啟動子。外援性LPA在0-3μmol/L濃度范圍內促進細胞的胰島素分泌。
　　結論：HBVpre-S2可定位于細胞核并激活能水解LPA的LYPLA-1