瘦素對胰島素合成、分泌和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響.pdf

1、第一部分 瘦素受體mRNA的表達與分布 目的瘦素受體的分布范圍廣泛，來源于小鼠的OB-R分布于脈絡(luò)叢、下丘腦、睪丸等處，而胰腺內(nèi)是否有分布尚有爭議，Tartaglia，Emilsson等認為胰腺內(nèi)有功能性O(shè)B-R的分布，而MurakamiT則認為無此受體分布。本試驗進一步探討并證實OB-R的分布。 方法選取4-6周齡的C57/BL6小鼠15只，手術(shù)獲取小鼠胰腺、心臟、肝臟、下丘腦等組織，應(yīng)用免疫組織化學(xué)及RT-P

2、CR方法檢測OB-R的存在。采用多克隆抗體法檢測OB-Rb。OB-Rb的引物序列為：SS5'-AGAATTGTTCCTGGGCACAAG,AS5'-ACACTCATCCTCACAGGTTCC。PCR反應(yīng)條件為95℃變性5分鐘，94℃60S變性，55℃60S退火，72℃60S延伸，反應(yīng)進行30個循環(huán)。72℃延伸7分鐘，反應(yīng)結(jié)束后瓊脂糖凝膠電泳檢測。 結(jié)果免疫組織化學(xué)方法證實，瘦素受體在C57/BL6小鼠的腦、胰腺、肝臟、心臟、腎臟

3、、脂肪等組織中均有表達，各組織胞漿內(nèi)為棕色表達，陰性為均一的藍染。RT-PCR方法證實，瘦素受體在C57/BL6小鼠的腦、胰腺、肝臟、心臟、腎臟、脂肪等組織中可見清晰的條帶。 結(jié)論除C57/BL6小鼠的下丘腦、心臟、肝臟、腎臟、脂肪組織外，瘦素受體在胰腺中有分布及表達。因此，瘦素與胰腺上存在的瘦素受體結(jié)合就可能對胰島素的合成和分泌產(chǎn)生影響。 第三部分 瘦素對離體胰島細胞胰島素分泌的影響 目的：通過體外培養(yǎng)

4、大鼠胰島細胞的方法研究瘦素對葡萄糖刺激的胰島素分泌的影響。 方法：取體重在250g-350g之間的SD大鼠為實驗對象，分離并純化其胰島細胞。將胰島細胞放于營養(yǎng)液中在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時，然后換營養(yǎng)液再培養(yǎng)1小時。以10個胰島為一個單位，放于一個培養(yǎng)孔中。首先觀察瘦素對不同濃度的葡萄糖刺激的胰島素分泌的影響，并摸索對胰島素作用明顯時的葡萄糖的濃度。將22個培養(yǎng)孔分成實驗組和對照組，實驗組中加入11種不同濃度(4mM-24mM)的葡萄

5、糖溶液、瘦素(10mM)，對照組中加入11種不同濃度的葡萄糖溶液、PBS液，培養(yǎng)2小時后用放免的方法測定培養(yǎng)液中胰島素的量。根據(jù)其結(jié)果，再取22單位的胰島，觀察22種不同濃度(0-1000ng/ml)的瘦素對胰島素分泌的影響。每個培養(yǎng)孔中加入葡萄糖液(12mM)和一種濃度的瘦素，共同培養(yǎng)30分鐘后用放免的方法測定培養(yǎng)液中胰島素的量。 結(jié)果：在不同濃度的葡萄糖刺激下，瘦素(10mM)對胰島素的分泌呈抑制作用，其中葡萄糖的濃度在12

6、mM的時候抑制作用最明顯。不同濃度的瘦素對葡萄糖(12mM)刺激的胰島素分泌的影響呈雙向性，太低和太高濃度都不能明顯抑制胰島素的分泌，只是在適宜的濃度下才能起到抑制作用。 結(jié)論：瘦素對不同濃度葡萄糖刺激的胰島素分泌呈抑制作用，不同濃度的瘦素對胰島素分泌的影響呈雙向性，只是在適宜的濃度下才能起到抑制作用。 第四部分 瘦素對大鼠前胰島素原mRNA表達的影響 目的瘦素對胰島素的影響成為近年來研究的熱點，瘦素對胰

7、島素分泌的雙向調(diào)節(jié)作用逐漸被人們發(fā)現(xiàn)，但是瘦素對胰島素合成的影響研究甚少，并且瘦素對大鼠前胰島素原的影響無人報道。本實驗?zāi)康脑谟谔接懯菟卦诓煌瑮l件下對大鼠前胰島素原mRNA表達的影響。 方法250-300gSD大鼠96只，雌雄不拘，隨機分成8組。第1，2組為在體實驗，其余組均為離體實驗。離體實驗中根據(jù)培養(yǎng)基條件不同分為葡萄糖濃度5.6mmol/L培養(yǎng)24小時組，葡萄糖濃度20.0mmol/L培養(yǎng)2小時組，葡萄糖濃度20.0mmo

8、l/L培養(yǎng)24小時組。應(yīng)用半定量RT-PCR技術(shù)檢測各組前胰島素原Ⅰ、ⅡmRNA的表達。 結(jié)果①正常葡萄糖濃度時，無論在體、離體實驗，瘦素組大鼠前胰島素原mRNA表達的變化均無統(tǒng)計學(xué)意義。②20mM葡萄糖濃度，體外培養(yǎng)2h時，瘦素組與對照組大鼠前胰島素原mRNA表達的變化無顯著性差異。③20mM葡萄糖濃度，體外培養(yǎng)24h時，瘦素組大鼠前胰島素原mRNA的表達明顯減少。 結(jié)論對于SD大鼠：①瘦素直接抑制前胰島素原mRNA的

9、表達。②瘦素抑制前胰島素原mRNA的表達呈時間依賴。③瘦素抑制前胰島素原mRNA的表達呈葡萄糖濃度依賴。這些結(jié)果提示瘦素對胰島β細胞合成胰島素功能有抑制作用。 第五部分 瘦素對胰島素受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響 目的瘦素對胰島素的合成和分泌均有影響，本文觀察瘦素對胰島素受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響。 方法胰島細胞在10cm的培養(yǎng)皿，在37℃，5﹪的CO2和95﹪潮濕空氣中培養(yǎng)至單層融合。融合的細胞單層分組，分別用

10、0、4、10、12mM瘦素(第1組、第2組、第3組、第4組)預(yù)溫育16h，然后用12mM瘦素急性刺激1min，未用藥物刺激的細胞作為對照組。用免疫沉淀法測定IRB、IRS21和IRS22的酪氨酸磷酸化水平及IRS21/22與P85的相關(guān)作用。用免疫印跡法測定IRB、IRS-1、IRS-2、P85的蛋白表達水平，利用ImageQuant軟件(MolecularDynamics)對免疫反應(yīng)條帶作自動掃描測量光密度，并轉(zhuǎn)換成相對百分數(shù)。

11、 結(jié)果在基礎(chǔ)狀態(tài)下，可檢測到的信號分子的酪氨酸磷酸化反應(yīng)極低。12mM瘦素急性刺激1min迅速引起了IRB、IRS-1和IRS-2的酪氨酸磷酸化、第1組各信號分子的蛋白表達水平、改變差異無顯著性。細胞用0、4、10、12mM瘦素溫育16h，IRB、IRS-1和IRS-2的酪氨酸磷酸化水平隨孵育瘦素濃度的增加而逐漸降低，在12mM瘦素存在下IRB、IRS-1和IRS-2的磷酸化降至最低值。與上述改變相平行，在瘦素處理后，IRS-1與P8