LPA對豬孤雌胚胎早期發(fā)育及多能性標志基因的影響.pdf

1、豬作為中國的大家畜，對中國的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展起著重要的作用。目前來說獲得豬多能干細胞的主要方法是通過體外分離和重編程，但是存在的主要問題都是沒有獲得“naive”狀態(tài)的豬ES細胞。為了進一步促進豬胚胎早期發(fā)育，獲得更利于分離培養(yǎng)獲得naive多能性狀態(tài)的胚胎干細胞(ES)的囊胚材料，在本實驗探討Lysophosphatidic acid(LPA)對豬孤雌胚胎早期發(fā)育以及相關多能性基因表達的影響并對其信號通路進行了初步探討。以期為下一步分離獲

2、得豬ES獲得良好的材料。研究結果總結如下:1.LPA(Lysophosphatidic acid)對豬孤雌胚胎早期發(fā)育以及相關胚層的影響。首先對LPA作用的濃度進行探索，從囊賠率、卵裂率以及囊胚細胞數(shù)來看，發(fā)現(xiàn)50μM的LPA處理濃度要顯著優(yōu)于其他處理組，并且囊胚質量也優(yōu)于對照組。為了進一步確認前面的試驗結果，從蛋白水平選用了OCT4抗體進行了免疫熒光染色，結果顯示，50μM的LPA處理濃度免疫熒光強度也優(yōu)于其他實驗組和對照組，所以確定

3、了50μM的LPA處理濃度進行了后續(xù)的實驗。隨后探索了LPA對原始內胚層、原始外胚層以及滋養(yǎng)層標志基因的影響。QRT-PCR結果顯示:LPA對原始外胚層標志基因沒有顯著影響，但是LPA可以顯著上調滋養(yǎng)層標志基因的表達并且可以極顯著地下調原始內胚層標志基因的表達。以上結果表明，LPA可以促進早期豬孤雌囊胚的發(fā)育，并且對豬早期胚胎原始內胚層有著重要的影響。2.LPA作用于豬孤雌胚胎相關信號通路的探索。首先探索FGF信號通路對豬孤雌胚胎原始內

4、胚層的影響，QRT-PCR結果顯示:30ng/mL的bFGF可以顯著上調豬囊胚原始內胚層GATA4基因。在同時添加LPA和bFGF后，豬囊胚原始內胚層標志基因GATA4和單獨添加LPA時結果一致，即GATA4基因顯著下降。隨后探索LPA是否通過ROCK信號通路起作用。使用ROCK信號通路抑制劑Y27632抑制ROCK信號通路表達以后再添加LPA后，豬囊胚原始內胚層標志基因GATA4沒有顯著變化。以上結果表明，與小鼠早期胚胎一樣，F(xiàn)GF信

5、號通路任然可以調節(jié)豬的原始內胚層的發(fā)育，而LPA主要通過ROCK信號通路對豬原始內胚層起作用，并且作用強度可能大于FGF信號通路。3.為了更進一步的研究LPA對豬早期囊胚發(fā)育中多能性基因表達的影響，對“naive”和“primed”兩類候選基因進行了定量測定，結果顯示:LPA對“naive”態(tài)基因沒有顯著影響，但是能顯著下調“primed”多能基因NODAL和Activin-A的表達，并且能顯著提高ES細胞自我更新因子OCT4和c-My