發(fā)育潛能不同的豬2-細(xì)胞期孤雌胚胎差異表達(dá)基因的篩選.pdf

1、胚胎的初次卵裂時(shí)間是衡量胚胎質(zhì)量和后續(xù)發(fā)育能力的重要指標(biāo)之一，以初次卵裂時(shí)間為基礎(chǔ)選擇發(fā)育能力不同的胚胎做研究對(duì)象，再通過相應(yīng)的試驗(yàn)技術(shù)可以使我們發(fā)現(xiàn)一些影響胚胎發(fā)育能力的母源基因。豬的胚胎基因組激活（Embryonicgenomeactivation，ZGA）在4-細(xì)胞期，如果之前的發(fā)育均由源自卵子的母源mRNAs調(diào)控，則早卵裂的胚胎與晚卵裂胚胎間各種mRNA豐度的不同將極可能表現(xiàn)在2-細(xì)胞期。鑒定出該時(shí)期表達(dá)豐度不同的mRNAs，可

2、以使我們獲得與胚胎發(fā)育能力有重要關(guān)系的母源基因，同時(shí)也有助于我們發(fā)掘胚胎早期發(fā)育過程中初次卵裂時(shí)間影響胚胎后續(xù)發(fā)育能力的原因。
　　 本試驗(yàn)以豬孤雌胚胎為材料，根據(jù)初次卵裂時(shí)間的早晚劃分出發(fā)育能力不同的兩組胚胎，比較其mRNAs豐度。利用mRNA差異顯示技術(shù)（mRNADifferentialDisplayReverseTranscriptionPCR，DDRT-PCR）篩選出兩組胚胎中表達(dá)豐度不同的mRNAs。采用反Northo

3、rn-blot技術(shù)進(jìn)行陽性片段的鑒定。利用PCR和5'RACE（Rapid-Amplification of cDNA Ends）技術(shù)對(duì)陽性片段E3所在的CPEB2基因進(jìn)行全長cDNA克隆。利用SYBRGreen熒光定量PCR技術(shù)得到了該基因在早期胚胎中的表達(dá)模式。
　　 1.經(jīng)反Northern-blot驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)有8條差異表達(dá)的陽性cDNA片段（E1-E4；L1-L4），其中四條（E1-4）在早卵裂（發(fā)育潛能較高）胚胎中表達(dá)

4、量較高；四條（L1-L4）在晚卵裂（發(fā)育潛能較低）胚胎中表達(dá)量較高。
　　 2.8條陽性片段克隆、測(cè)序后與GenBank中豬的基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對(duì)分析，其中6條（E1，E2，E3，L1，L2，L4）與已知豬的ESTs有較高的同源性。
　　 3.經(jīng)過與GenBank中人的基因數(shù)據(jù)庫對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在卵裂較快的胚胎中表達(dá)量較高的E3與人CPEB2的同源性為97％；在卵裂較慢的胚胎中表達(dá)量較高的L3與人hnRNPA1的同源性89