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文檔簡介
1、妊娠期豬胚胎/胎兒死亡會導(dǎo)致產(chǎn)仔數(shù)降低,而胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩會造成低初生重仔豬數(shù)目增加,這些低出生重的仔豬對疾病的抵抗能力及飼料利用率均降低,因此,嚴(yán)重影響母豬的繁殖效率。胚胎的附植及胎盤的建立和發(fā)育直接影響著胎盤效率,是成功妊娠的重要過程。胎盤的大小及轉(zhuǎn)運(yùn)功效決定了胎盤效率的高低,在附植前期及附植期,豬孕體滋養(yǎng)層會經(jīng)歷一個(gè)形態(tài)迅速重塑的過程,其形態(tài)從球形(約10mm)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫€狀(約150mm),滋養(yǎng)層擴(kuò)張重塑的目的是在子宮中占據(jù)足夠
2、的位置進(jìn)行附植,因而也決定了胎盤的大小。隨后孕體滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞粘附形成上皮絨毛膜型胎盤,建立母體與胎兒之間的轉(zhuǎn)運(yùn)通道。因此本研究首先以滋養(yǎng)層快速重塑的球形和線形孕體為材料,通過差異表達(dá)基因的篩選,檢測與豬胚胎附植及胎盤建立相關(guān)的基因及調(diào)控通路。其次,從差異表達(dá)基因中選取PLET1基因?yàn)楹蜻x基因,研究該基因在胎盤建立及發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制,研究結(jié)果如下:
1.通過芯片雜交分析分別篩選到梅山和大白豬的球形和線狀孕體中
3、的差異表達(dá)基因,對比發(fā)現(xiàn)只在大白豬中上調(diào)表達(dá)的基因有410個(gè),下調(diào)表達(dá)的基因有634個(gè)。只在梅山豬中上調(diào)表達(dá)基因288個(gè),下調(diào)表達(dá)基因292個(gè)。因此,大白豬孕體中的差異表達(dá)基因遠(yuǎn)多于梅山豬,即梅山豬孕體在附植前期的基因表達(dá)更趨于平穩(wěn)。此外,兩個(gè)品種中共同上調(diào)表達(dá)基因有345個(gè)和共同下調(diào)表達(dá)基因有379個(gè),推測這些基因可能是調(diào)控孕體發(fā)育所必需的基因。對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分類和信號通路分析,發(fā)現(xiàn)兩個(gè)品種豬孕體中差異表達(dá)基因均涉及與血管生成
4、、激素應(yīng)答、細(xì)胞增殖等,說明這些過程是孕體延長所必需的,同時(shí)也發(fā)現(xiàn)只在梅山豬孕體中差異表達(dá)基因涉及的信號通路主要是與細(xì)胞外基質(zhì)作用、胺類生物合成、黏著斑等少數(shù)信號途徑,而只在大白豬孕體中差異表達(dá)基因則涉及激素合成、補(bǔ)體系統(tǒng)、粘多糖降解、鈣離子信號途徑等多個(gè)信號通路,也說明大白豬孕體在延長過程中基因表達(dá)變化可能會引起細(xì)胞的許多功能發(fā)生改變。
2.PLET1是一個(gè)在形態(tài)重塑期的梅山豬和大白豬孕體中均上調(diào)表達(dá)的基因,推測其表達(dá)可能對
5、孕體滋養(yǎng)層的延長是必要的。我們首先檢測PLET1基因的表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)PLET1在囊胚期表達(dá)量較低,而在附植后直到整個(gè)妊娠末期表達(dá)量迅速上升,驗(yàn)證了PLET1基因是一個(gè)胚胎延長期的差異表達(dá)基因,并且發(fā)現(xiàn)PLET1基因在豬胎盤發(fā)育過程中也是上調(diào)表達(dá),說明其可能也參與胎盤的發(fā)育過程。
3.對豬PLET1基因的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn):(1)通過原位雜交及免疫熒光檢測到PLET1只在孕體和胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá),證明其可以作為胎盤中滋養(yǎng)層細(xì)胞的標(biāo)記
6、基因,用于滋養(yǎng)層細(xì)胞的分選。(2) PLET1在妊娠不同時(shí)期的滋養(yǎng)層細(xì)胞中的表達(dá)定位也發(fā)生變化,即從妊娠50天開始,隨著胎盤褶皺的形成和進(jìn)一步發(fā)育,PLET1蛋白逐漸向滋養(yǎng)層細(xì)胞頂端聚集,表達(dá)位置進(jìn)一步貼近母體子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞,推測PLET1可能影響滋養(yǎng)層細(xì)胞與母體子宮內(nèi)膜細(xì)胞的相互作用。(3)通過3'RACE技術(shù)鑒定到豬胎盤中表達(dá)3'UTR長度不同的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本,證實(shí)這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本是由于選擇性加尾信號導(dǎo)致的,并且熒光定量分析結(jié)果顯示,兩個(gè)
7、轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量比值隨著妊娠的進(jìn)程而改變,說明雖然這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本編碼相同的蛋白質(zhì),但是它們在胎盤的發(fā)育過程中發(fā)揮的功能可能并不完全相同。(4)在體外細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)PLET1基因的長轉(zhuǎn)錄本表達(dá)活性更高,并且PLET1的表達(dá)受miR-181a、miR-181c和miRNA-365-3p的調(diào)控。
4.對PLET1蛋白進(jìn)行氨基酸序列分析,預(yù)測其可能存在N-連接的糖基化修飾,經(jīng)蛋白質(zhì)糖基化檢測發(fā)現(xiàn)PLET1蛋白在胎盤中主要是以糖基化形式存
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