MEF差異表達(dá)基因的篩選.pdf

1、該課題主要應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)構(gòu)建培養(yǎng)后MEF細(xì)胞相對(duì)于原代MEF細(xì)胞籌異表達(dá)基因的cDNA消減文庫,并運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析所獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以期查找出其中對(duì)ES細(xì)胞增殖分化有重要調(diào)控作用的基囚群.首先提取對(duì)培養(yǎng)前（driver）、后（t est er）的MEF mRNA,與商售的cDNA ExpressionArray尼龍雜交膜進(jìn)行微陣列法雜交檢測,在已知基因范圍內(nèi)進(jìn)行初步分析.對(duì)培養(yǎng)前、后的MEFmRNA進(jìn)行抑制性消減雜交分

2、析.將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,經(jīng)Rsal酶切后將實(shí)驗(yàn)組（tester）分為兩組,分別與2種不同的接頭連接,再與對(duì)照組（driver） cDNA進(jìn)行兩次消減雜交及兩次抑制性PCR.將產(chǎn)物與pGEM-T載體連接,構(gòu)建cDNA消減文庫,并轉(zhuǎn)染大腸桿菌進(jìn)行文庫擴(kuò)增,隨機(jī)挑取陽性克隆PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測序與同源性分析.結(jié)果顯示,培養(yǎng)后MEF相對(duì)于胚胎成纖維細(xì)胞確實(shí)存在差異表達(dá)基因群,在微陣列法中檢測到24類差異表達(dá)的基因.抑制性差減雜交分析,成