豬肺組織中差異表達(dá)基因的篩選.pdf

1、目前，豬呼吸系統(tǒng)疾病已成為我國許多規(guī)?；i場和農(nóng)村養(yǎng)豬大戶十分關(guān)注的問題。豬的呼吸道疾病被認(rèn)為是困擾豬場生產(chǎn)經(jīng)營的主要問題之一，是造成最大經(jīng)濟(jì)損失的疾病。 豬呼吸系統(tǒng)疾病是多種因素綜合作用的結(jié)果，除了傳染性、環(huán)境以及管理因素等以外，還包括遺傳因素。對豬肺組織炎癥抗性的基因表達(dá)調(diào)控和分子機(jī)制目前還不是很清楚，本研究旨在通過分離和克隆與豬肺組織炎癥抗性相關(guān)基因的探索性研究，初步揭示參與肺組織炎癥抗性的基因種類和數(shù)量，為進(jìn)一步深入開展

2、肺組織炎癥抗性的分子機(jī)理研究及將來通過遺傳選擇提高肺組織炎癥的抗性提供理論基礎(chǔ)。 1：本實驗中首先應(yīng)用抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)成功構(gòu)建了豬病變肺組織與健康肺組織差異表達(dá)cDNA文庫。以大白豬為材料，通過SSH方法技術(shù)初步篩選到部分基因差異表達(dá)序列，并將這些序列產(chǎn)物純化后與pGM-TEasy載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行文庫擴(kuò)增，最終構(gòu)建得到了具有高消減效率的豬肺組織炎癥抗性相關(guān)cDNA文庫。文庫擴(kuò)增后得到42

3、2個白色陽性克隆，隨機(jī)挑選21個克隆進(jìn)行PCR鑒定，鑒定結(jié)果表明插入片段主要分布在150-500bp之間。 2：隨后將從抑制性消減雜交過程中篩選到的初步差異表達(dá)的基因片段，經(jīng)過反Northern斑點雜交技術(shù)從消減cDNA文庫中高通量篩選得到422個差異表達(dá)的克隆。分別用地高辛標(biāo)記豬病變肺組織和無病變肺組織cDNA作為雜交探針，對構(gòu)建的cDNA消減文庫利用反向Northern斑點雜交技術(shù)篩選了41個差異表達(dá)克隆，測序后得到34個滿

4、意的EST序列。 3：根據(jù)在GenBank非冗余核酸數(shù)據(jù)庫(nr)和EST數(shù)據(jù)庫中BLASTn序列比對結(jié)果，將這些ESTs分為2類：第一類代表已知基因，共12個；第二類代表已知EST，共22個。代表已知基因的ESTs按照基因功能分為六類：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞間通信、細(xì)胞結(jié)構(gòu)與運(yùn)動、細(xì)胞與機(jī)體防御、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯與表達(dá)調(diào)控及其它。 4：結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)初步探討了部分豬肺組織炎癥抗性相關(guān)差異表達(dá)基因的作用和意義，其中豬免疫球蛋白重鏈基