豬孤雌胚早期不同發(fā)育階段基因差異表達(dá)的初步研究.pdf

1、胚胎在早期發(fā)育過程中，其形態(tài)和生理會發(fā)生很多的變化，包括對后期胚胎發(fā)育潛能起決定作用的第一次卵裂、合子基因組的激活、桑葚胚的致密化和囊胚的形成等。這些轉(zhuǎn)變過程往往都伴隨著與發(fā)育相關(guān)基因的差異表達(dá)與調(diào)控，對豬卵母細(xì)胞激活及孤雌胚發(fā)育進(jìn)行研究的目的，正是為了更好的了解哺乳動物胚胎早期發(fā)育過程中基因差異表達(dá)的情況，以期為哺乳動物胚胎發(fā)育分子調(diào)控機(jī)制的研究提供參考。同時這對深入細(xì)致地研究動物克隆技術(shù)，建立孤雌哺乳動物品系以及加速家畜育種進(jìn)程等均

2、具有重要意義。
　　 豬胚胎培養(yǎng)的相關(guān)資料顯示，現(xiàn)在的體外培養(yǎng)條件不能完全模擬體內(nèi)的環(huán)境[l]。因此，通過比較同一類細(xì)胞在不同生理狀態(tài)下或在不同生長發(fā)育階段的基因表達(dá)差異，可為分析生命活動過程提供重要信息。為了鑒別和分離早期孤雌發(fā)育的胚胎表達(dá)差異的基因，了解體外產(chǎn)生的早期胚胎mRNA表達(dá)模式，本研究主要利用了DDRT-PCR(differential display reversetranscription polymerase

3、 chain reaction，DDRT-PCR)技術(shù)，來分析豬體外成熟的早期孤雌激活胚，包括2-細(xì)胞胚胎、4-細(xì)胞胚胎、桑葚胚以及囊胚等四個時期的胚胎mRNA的表達(dá)，并且需分離得到各個時期特異性表達(dá)的基因片段。為此，我們分別提取了豬早期發(fā)育的2-細(xì)胞胚胎（60個）、4-細(xì)胞胚胎（60個）、桑葚胚（63個）以及囊胚(61個)的總RNA，按照應(yīng)有的體系反轉(zhuǎn)錄。然后將各個時期的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacr

4、ylamide gel electrophoresis，PAGE)分離并銀染后，回收共得到22條早期胚胎的差異表達(dá)片段，其中僅有11條在二次擴(kuò)增時可以重復(fù)出現(xiàn)，最終對10個差異表達(dá)基因進(jìn)行了克隆并送去測序。將8個測序結(jié)果經(jīng)過BLAST比對后發(fā)現(xiàn)，有7條差異表達(dá)片段分別比對上了人上皮型鈣粘附蛋白(E-cadherin)基因、歐洲野豬的CWF19-L2基因、小鼠Amdl(adenosylmethionine decarboxylase l)